培養組學聯合MALDI-TOF MS技術對醫院環境中昆蟲標本的菌群分析*

張 微，崔生輝，翁 蕊，王 輝，侯 軒，張清雯，趙 磊，牟 建，段發強，辜依海△

1.三二〇一醫院微生物免疫科，陜西漢中 723000；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；3.陜西中醫藥大學醫學技術學院，陜西咸陽 712046

昆蟲作為地球上數量最多且分布最廣的動物群體[1-2]，除存在大量腸道菌群外[3-4]，其身體外露部分也攜帶著多種病原體[5]，可成為細菌和其他病原體的有效載體[2,6]。昆蟲具有很強的流動性，它們可以接觸到人類糞便、垃圾、開放性傷口或受污染的醫療器械，是連接醫院內外感染區和未感染區的重要媒介[7]。盡管醫院環境和其他醫療保健機構對昆蟲實施了控制措施，但據報道，昆蟲在醫院病房中持續存在[8-10]。BOIOCCHI等[2]在英國7家醫院共收集19 937只昆蟲，以雙翅目為主，從雙翅目昆蟲中共鑒定出82株細菌，對其中68株細菌進行了藥敏試驗，52.9%的細菌表現出對至少一類抗菌藥物耐藥[2]。HEIDEN等[11]研究了某三級醫院的蠅類發現，有一半蠅類攜帶強毒性的多重耐藥病原體。因此，對醫院環境中昆蟲攜帶的微生物進行分析和研究，會為疾病的防控提供新思路。

目前對昆蟲腸道菌群進行研究的常用組學技術包括培養組學、宏基因組學、蛋白質組學以及代謝組學[12]，培養組學基于培養條件的多樣性，盡可能地模仿細菌所處的自然環境，以獲取培養物[13]。不同于傳統細菌培養的方法，培養組學可以聯合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)技術進行細菌鑒定[14]。MALDI-TOF MS是通過細菌、真菌的特征性蛋白圖譜對目標微生物進行鑒定，因其耗材低廉、處理流程簡單、耗時短且準確性高的特點而被廣泛使用，LUO等[15]研究表明MALDI-TOF-MS的鑒定準確率達到95%以上。在國際上有關于醫院環境中昆蟲標本菌群分析的報道，但是國內相關報道較少，本研究采用培養組學聯合MALDI-TOF MS技術對醫院環境中昆蟲標本的菌群進行分析，旨在闡明其分布特征、耐藥性及培養組學聯合MALDI-TOF MS技術對昆蟲標本菌群分析的實用性。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 主要儀器包括T214電子分析天平、GHP-9080培養箱、Hfsafe-1800TE生物安全柜、Microflex LT/SH型質譜儀(德國布魯克公司)。主要的耗材和試劑包括TSA瓊脂培養基(北京陸橋技術有限責任公司)、中國藍平板(溫州市康泰生物科技有限公司)、HCCA基質(德國Bruker公司)、生理鹽水(國藥集團容生制藥有限公司)，細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，天根生物科技有限公司)，革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(上海星佰生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1標本采集 采樣地點為某醫院院內和醫院周邊環境，取樣后裝入無菌痰杯中，立即送往實驗室檢測。

1.2.2標本處理 (1)取昆蟲標本一個，加入無菌管中，用千分之一天平稱重，記錄昆蟲名稱和重量。(2)加入標本10倍重量或不少于1 mL的生理鹽水，磨碎樣品；用生理鹽水稀釋至10-6稀釋度；將原液至10-6稀釋度的梯度稀釋液分別用消毒后的L型玻璃棒涂布于胰蛋白胨大豆瓊脂平板和中國藍平板，每個梯度的稀釋液涂布2塊平板，37 ℃需氧培養24～48 h；(3)取原液0.5 mL，3 000×g離心10 min，棄去上清后，加入1 mL 75%乙醇，重懸，室溫放置5 min，3 000×g離心10 min，棄去上清。加入生理鹽水0.5 mL，重懸；用生理鹽水將原液稀釋至10-6稀釋度；將原液至10-6稀釋度的梯度稀釋液分別用消毒后的L型玻璃棒涂布于TSA平板，每個梯度的稀釋液涂布2塊平板，37 ℃需氧培養24～48 h。隨后對平板上所有生長的菌落進行MALDI-TOF MS鑒定。

1.2.3MALDI-TOF MS鑒定 先采用甲酸直接涂抹法對菌株進行鑒定，無法鑒定的菌株采用甲酸/乙腈萃取法重新進行MALDI-TOF MS鑒定。(1)甲酸直接涂抹法：挑取TSA瓊脂培養基和中國藍平板上的菌落涂布于MALDI-TOF MS 靶板上，加入甲酸(1 μL/孔)，自然晾干后，在靶孔加1 μL/孔的α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)基質溶液，晾干后,將靶板放回機器對菌株種屬進行鑒定，質荷比(m/z)為2 000～20 000。(2)甲酸/乙腈萃取法：取待測微生物標本轉移至盛有300 μL超純水的EP管中，用移液器反復吹打，渦旋至少1 min，在管中形成均勻的菌懸液；加入900 μL無水乙醇，渦旋至少1 min，13 000 r/min離心2 min，棄上清，重復離心一次，去乙醇溶液；加入50 μL70%甲酸溶液，反復吹打，渦旋混勻，加入50 μL乙腈，用移液器反復吹打混勻；13 000 r/min離心2 min，取上清1 μL至MALDI-TOF MS靶板上，晾干后，覆蓋1 μL HCCA基質溶液，晾干后，通過質譜儀鑒定，m/z為2 000～20 000。

1.2.4全基因組測序 MALDI-TOF MS無法鑒定的菌株參照試劑盒說明書提取基因組DNA后送至北京諾禾致源公司測序，使用二代測序平臺Illumina Hiseq 2000、PE150開展全基因組測序分析。

1.2.5藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法對臨床常見腸桿菌目分離株進行抗菌藥物的藥敏試驗；根據革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板說明書進行操作，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，根據2021年美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)的相應標準判讀結果[16]。

2 結 果

2.1昆蟲類別 共采集昆蟲標本16只，包括瓢蟲、天牛、螞蟻、非洲蜂、黃胡蜂、金牛、蟋蟀、蜘蛛、長腳盲蛛、草蛉、蚊子、長腳蚊、枯葉蛾、飛蛾、粉蝶和棕靜螳，以非叮咬類昆蟲為主，見表1。

2.2從昆蟲標本分離得到菌株的數量及分布 從16只昆蟲標本共分離得到104株菌，其中6株(5.77%)無法通過MALDI-TOF MS鑒定，其余鑒定結果均在可信范圍內。所有昆蟲標本中，非洲蜂和粉蝶分離到的菌株較多，分別為14株和15株；分離株數為6～<10種的昆蟲標本包括瓢蟲、黃胡蜂、金牛、蟋蟀、草蛉、長腳蚊、飛蛾和枯葉蛾；含菌量較低(<6株)的是螞蟻和蜘蛛，從長腳盲蛛標本中未分離到菌株。經過乙醇處理后，共分離菌株8株，均為芽孢桿菌。見表1。

表1 昆蟲類別及菌株分離情況

MALDI-TOF MS鑒定的98株菌中，57.14%(56/98)為革蘭陽性菌，41.84%(41/98)為革蘭陰性菌，1.02%(1/98)為真菌(葡萄牙棒孢酵母菌，檢出于金牛標本)。革蘭陽性菌中芽孢桿菌屬為分離率最高的菌屬，占53.57%(30/56)，分離自粉蝶、棕靜螳和螞蟻標本；凝固酶陰性葡萄球菌占12.50%(7/56)，多分離自膜翅目類昆蟲；腸球菌屬占8.93%(5/56)，分離自天牛、金牛、蟋蟀、蚊子和粉蝶標本。革蘭陰性菌中以腸桿菌目細菌為主，占70.73%(29/41)，分離自非洲蜂標本的比例最高，部分腸桿菌目細菌分離株見圖1；非發酵菌占21.95%(9/41)。

2.3MALDI-TOF MS菌株鑒定分值 98株菌中MALDI-TOF MS平均鑒定分值為2.075，最高鑒定分值為2.522，最低鑒定分值為1.714，鑒定分值高于2.000共63株，占64.29%，革蘭陰性菌平均鑒定分值為2.151，革蘭陽性菌平均鑒定分值為2.027，革蘭陰性菌鑒定分值略高于革蘭陽性菌。

2.4無法鑒定的菌株采用甲酸/乙腈萃取法重新鑒定的情況 從草嶺和蚊子標本中各分離了1株無法鑒定的菌株，均在復蘇過程中死亡，故無法進一步地鑒定。對其他4株無法鑒定的菌株采用甲酸/乙腈萃取法重新進行MALDI-TOF MS鑒定，鑒定分值均在1.6以下，無法鑒定至種屬，見表2。

表2 昆蟲標本中無法鑒定菌株兩次鑒定的分值及測序鑒定的結果

2.5全基因組測序鑒定 無法鑒定的菌株通過全基因組測序鑒定為塔斯曼尼亞歐文菌、牛類芽孢桿菌、Paenibacillus aquistagni和藤黃微球菌。

2.6藥敏試驗 對腸桿菌目細菌進行抗菌藥物的敏感性試驗，昆蟲來源的腸桿菌目細菌對抗菌藥物敏感性較高，僅3株菌對頭孢唑啉耐藥，6株菌對四環素耐藥，1株菌對復方磺胺甲噁唑耐藥，其他菌株對檢測的藥物均敏感，見圖1。

注：AMP為氨芐西林；AMS為氨芐西林/舒巴坦；CFZ為頭孢唑啉；CTX為頭孢噻肟；CFX為頭孢西丁；CAZ為頭孢他啶；IPM為亞胺培南；GEN為慶大霉素；TET為四環素；CIP為環丙沙星；SXT為復方磺胺甲噁唑；CHL為氯霉素；白色塊表示敏感；灰色塊表示耐藥；*表示天然耐藥。

3 討 論

在微生物鑒定方面，傳統鑒定方法，如依靠菌落形態和生化反應的鑒定方法，因其特異性低、鑒定細菌種類有限等缺點不能完全滿足臨床實際需要，雖然16S RNA基因測序分析技術、基因芯片分析技術、PCR技術能夠成為手工鑒定方法的替代方法，但其操作復雜、耗時長且試驗成本較高，而MALDI-TOF MS技術與常規生化方法和其他替代方法相比，具有方便、快速、準確等優點，在常規工作流程中，MALDI-TOF MS可以使微生物鑒定時間縮短1 d左右，同時由于改進了微生物菌落樣品的制備方法，其鑒定的準確性和速度得到進一步提高[17]。MALDI-TOF MS質譜鑒定系統的可靠性通過0～3的鑒定分值來確定，分值<1.700被認為是不可靠的鑒定結果，分值為1.700～<2.000可以鑒定為屬的水平，分值>2.000可以鑒定為種的水平[18]。本研究通過MALDI-TOF MS對從昆蟲標本中分離的104株菌進行鑒定，98株菌的鑒定分值均在1.700以上，平均鑒定分值為2.075，屬于可靠的鑒定結果，鑒定效率達94.23%，與MARKO等[18]的鑒定結果相當。

在應用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定的過程中，常用的操作方法是直接挑取菌落涂布于靶板上，滴加甲酸后進行鑒定，這種方法操作簡單、快速，可以高精度地進行細菌鑒定[17]。但是革蘭陽性細菌由于細胞壁結構的原因，細胞中蛋白質暴露不徹底，也會采用甲酸/乙腈萃取法。LEE等[19]的研究表明，甲酸/乙腈法的鑒定結果優于單獨甲酸法的鑒定結果。本研究中對直接甲酸法無法鑒定的4株菌，采用甲酸/乙腈萃取法重新進行鑒定，但是仍然無法給出可靠的鑒定結果，其可能原因為該質譜儀菌庫中無此細菌或者是細胞中的蛋白質仍然無法徹底暴露，造成該4株菌無法鑒定。通過全基因組測序技術鑒定的塔斯曼尼亞歐文菌，該菌為革蘭陰性，兼性厭氧，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，GEIDER等[20]于2006年首次從果樹中分離出來；牛類芽孢桿菌為革蘭陽性，過氧化氫酶陽性，需氧或兼性厭氧，屬于芽孢桿菌屬，GAO等[21]2016年報道從牦牛乳分離得到；Paenibacillus aquistagni為革蘭陽性，氧化酶陽性，過氧化氫酶陽性，兼性厭氧，SIMON等[22]2017年報道從工業廢水中分離得到。

目前，國內外已經對醫院昆蟲及其傳播病原體的潛力進行了研究，但是，大多數研究中的昆蟲主要集中在一個類型，特別是對爬行昆蟲的研究較多，例如蟑螂或螞蟻[23-24]。本研究中，除采集了螞蟻之外，在醫院環境中同時采集了瓢蟲、天牛、非洲蜂、黃胡蜂、金牛、蟋蟀、蜘蛛、長腳盲蛛、草蛉、長腳蚊、枯葉蛾、飛蛾、粉蝶、棕靜螳等昆蟲，涉及鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目、蜘蛛目、脈翅目、雙翅目、鱗翅目、螳螂目。所有分離株中革蘭陽性菌56株(57.14%)，革蘭陰性菌共41株(41.84%)，與KAPPEL等[7]的研究中分離到的優勢菌一致，但不同的是，本研究中革蘭陰性菌的分離率高于該研究。BOIOCCHI等[2]也報道腸桿菌目細菌為昆蟲標本中的優勢菌。本研究中的腸桿菌目細菌的耐藥率較低，這與文獻[2]的報道有所差異，可能是由于地理環境和采樣環境的不同所造成的。本研究分離到的革蘭陽性菌中，芽孢桿菌為優勢菌，這與之前報道一致[2]。在所有昆蟲中，膜翅目中的非洲蜂和鱗翅目中的粉蝶分離的細菌最多，分別為14株和15株。非洲蜂中的優勢菌株為革蘭陰性菌，共9株，主要為腸桿菌目細菌；粉蝶中有11株為芽孢桿菌，但是仍然有陰溝腸桿菌、克羅諾桿菌屬、解鳥氨酸克雷伯桿菌及糞腸球菌等臨床常見致病菌。在醫院環境中須注重這兩類昆蟲的防護，避免其攜帶的菌株在醫院傳播。

本研究中所采集的16只昆蟲，經過乙醇處理后，有5只昆蟲有菌生長，分別是非洲蜂、蟋蟀、飛蛾、粉蝶和棕靜螳，其生長的菌株均為芽孢桿菌屬，無腸桿菌目細菌或葡萄球菌屬細菌生長。本研究表明75%乙醇可以殺滅大部分昆蟲標本中的細菌，特別是革蘭陰性菌和除芽孢桿菌外的革蘭陽性菌，在醫院環境中可以作為常規消毒產品使用。

綜上所述，培養組學聯合MALDI-TOF MS鑒定系統能夠高效地對醫院環境中的昆蟲標本所攜帶的菌株進行種屬鑒定，雖然在所有菌株中革蘭陽性菌為優勢菌株，但是昆蟲標本中分離到的臨床常見革蘭陰性菌也應該引起重視，其可能成為潛在的病原菌。所以在醫院環境中，應該采取合適的防護措施，避免昆蟲流動。同時本研究也為臨床感染風險評估和預防控制策略提供了新思路。