慢性真菌性鼻-鼻竇炎病原學分析*

隋文君，胡旭辰，劉向祎△

1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院檢驗科,北京 100730；2.首都醫科大學2017級醫學檢驗技術專業,北京 100069

真菌性鼻-鼻竇炎(FRS)是一種獨立的特異性感染性鼻部炎癥性疾病[1]。慢性真菌性鼻-鼻竇炎(CFRS)是慢性鼻-鼻竇炎(CRS)的一種，通常根據真菌感染是否僅局限在鼻竇腔內，是否侵犯黏膜和骨壁等病理特點，將CFRS分為真菌感染侵犯鼻竇黏膜與骨壁的慢性侵襲型真菌性鼻-鼻竇炎(CIFRS)和感染僅在鼻竇腔內的慢性非侵襲性真菌性鼻-鼻竇炎(CNIFRS)兩大類。CNIFRS進一步根據病理改變的不同分為真菌球型鼻竇炎(FB)和變應性真菌性鼻-鼻竇炎(AFRS)[2]。AFRS發病率為5%～10%[3]。近年來，由于空氣污染嚴重，慢性病(如糖尿病、腫瘤等)多發和抗菌藥物的不合理應用使得CFRS發病率逐年上升,其在中國和歐洲人群中的發病率分別為8%和10.9%[4-5]。然而，CFRS的病原學數據尚不完善，并且其確切病因和發病機制尚未完全闡明。CFRS作為感染性疾病必然與微生物感染、微生態環境和宿主免疫反應密切相關[6]。隨著病原微生物檢測技術的不斷發展，CFRS的病原學數據越來越豐富。本課題組通過分析2016-2020年CFRS患者的臨床資料及從其鼻內鏡手術中獲取的鼻分泌物標本的微生物培養數據，獲取了CFRS的病原學信息，旨在為其發病機制的研究提供病原學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016—2020年于北京同仁醫院就診的經臨床特征、鼻內鏡檢查、影像學和病理學檢測確診為CRS的患者共756例納入研究，男性205例、女性551例，年齡10～87歲，病程1～4年。

1.2儀器與試劑 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(德國Bruker公司);革蘭染色液、乳酸酚棉藍染液(北京威泰克公司);血瓊脂平皿、巧克力瓊脂平皿和麥康凱瓊脂平皿(Thermo Fisher公司);厭氧血瓊脂平皿、固體沙保羅平皿和轉運拭子(天津金章公司)。

1.3方法

1.3.1收集臨床資料 收集并記錄所有納入研究者的臨床資料，包括性別、年齡、臨床診斷、病變部位等。

1.3.2標本采集 所有患者均行鼻內鏡下鼻竇開放竇腔內容物清除術進行標本采集。CFRS的內容物一般呈棕色或棕綠色干酪樣或泥沙狀，非真菌性CRS的內容物多為黏性或黏膿性。所有標本置于含有保存培養基的轉運拭子中保存和轉運，均在60 min內送至微生物室進行培養。

1.3.3涂片鏡檢及培養鑒定 直接鏡檢:取標本少許涂于3張載玻片上，其中2張用于真菌鏡檢，分別進行氫氧化鉀溶液(2.5 mol/L)壓片和乳酸酚棉藍染液壓片，蓋上蓋玻片觀察真菌特異結構(如真菌孢子和菌絲)；第3張用于革蘭染色，觀察炎癥細胞及細菌形態。所有送檢標本接種于不同培養基并置于不同培養環境進行普通細菌、厭氧菌和真菌的培養。血瓊脂平皿、巧克力瓊脂平皿置于35 ℃、5% CO2環境培養2～3 d;麥康凱瓊脂平皿置于35 ℃環境培養2～3 d;厭氧血瓊脂平皿置于35 ℃厭氧箱培養2～5 d;沙保羅培養皿置于25 ℃環境培養5～28 d。主要采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)進行微生物鑒定；真菌菌種鑒定除采用MALDI-TOF MS鑒定外，同時還需要結合真菌形態學進行鑒定，主要包括菌落形態及壓片鏡檢真菌的菌絲、孢子和產孢結構、方式等特征。如果兩種方法鑒定結果不一致，則進行真菌內轉錄間隔區(ITS)測序鑒定。

2 結 果

2.1CFRS患者的臨床特征分析 納入研究的CRS患者中，CFRS患者占56.3%(426/756)，非真菌性CRS患者占43.7%(330/756)。CFRS多見于成年人，女性多發,上頜竇病變所占比例最高[66.2%(282/426)]，見表1。426例CFRS均為CNIFRS，其中真菌球(FB)占56.1%(239/426)，AFRS占43.9%(187/426)。FB多為女性，病變部位多為單側鼻竇，而AFRS多累及雙側/全組鼻竇，兩者患者的性別構成、病變累及部位比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2016—2020年426例CFRS患者臨床特征分析

表2 2016—2020年FB、AFRS患者臨床特征比較

2.2CFRS的病原學分布 從426例CFRS患者的臨床標本中：共分離出真菌226株，其中曲霉菌197株(87.2%，包括黃曲霉99株、煙曲霉81株和其他曲霉17株)、鏈格孢霉11株、普通裂褶菌4株、尖端賽多孢子菌9株；共分離出細菌345株，分離數量排前3位的為凝固酶陰性葡萄球菌(58株)，金黃色葡萄球菌42株，銅綠假單胞菌32株，厭氧菌主要為普雷沃菌(9株)、具核梭桿菌(3株)、消化鏈球菌(6株)和丙酸桿菌(7株),見表3。CFRS患者中單純真菌感染216例(50.7%)，真菌、細菌混合感染210例(49.3%)，其中混合感染1種細菌83例(19.5%)，混合感染2種及以上細菌127例(29.8%)，未發現真菌混合感染的病例，見表4。

表3 2016—2020年CFRS的病原體分布情況

續表3 2016—2020年CFRS的原體分布情況

表4 2016—2020年CFRS患者真菌、細菌混合感染情況分析[n(%)]

2.3FB與AFRS患者真菌培養結果比較 培養結果顯示FB患者中真菌培養陽性157例(65.6%)；AFRS患者中真菌培養陽性69例(36.9%)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=34.93，P<0.001)。FB和AFRS均以曲霉菌為主要致病真菌，但AFRS感染的真菌中鏈格孢霉(13.04%)和尖端賽多孢子菌(10.14%)所占比例高于FB患者(均為1.27%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4混合細菌感染的CFRS與非真菌性CRS細菌病原學分布比較 混合細菌感染的CFRS(210例)與非真菌性CRS(330例)的細菌病原學分布情況見表5。CFRS和非真菌性CRS的細菌病原學分布較為接近，差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 混合細菌感染的CFRS和非真菌性CRS的細菌病原學分布[n(%)]

3 討 論

真菌廣泛存在于自然環境中，大多屬于條件致病菌。真菌感染多發生于免疫缺陷(接受移植、糖皮質激素或免疫抑制藥治療，有HIV感染或白血病等)、菌群失調(廣譜抗菌藥物的大量應用)和糖尿病患者[7-8]。然而，文獻報道CNIFRS常見于免疫力正常個體[9]。自真菌性鼻竇炎作為一種獨立的疾病被報道以來，研究發現絕大多數真菌性鼻竇炎不僅侵犯鼻竇，而且同時還侵犯鼻腔，因此美國耳鼻咽喉科學會建議用FRS來代替真菌性鼻竇炎[1]。FB患者竇腔內表現為致密的團塊，由綠色、黃色、棕色或黑色的易碎乳酪狀物質組成，很容易從竇腔黏膜上剝離[10]。AFRS則表現為對真菌抗原的超敏反應[11]。目前最常用的AFRS診斷標準是經典的Bent-Kuhn診斷標準，包括IgE介導的針對真菌的Ⅰ型超敏反應、CRS合并鼻息肉的存在、特征性CT特征、嗜酸性黏蛋白的存在以及真菌的特殊染色或培養陽性[12]。但目前真菌培養陽性率較低，并且FRS的病原學數據尚不完善。因此，本研究分析了2016—2020年北京同仁醫院CFRS患者的病例資料和病原學數據。

本研究共收集了CFRS患者426例，其中包括239例(56.1%)FB和187例(43.9%)AFRS。有文獻報道，FB好發于成年女性，主要累及單側鼻竇，以上頜竇最為多見，其次是蝶竇，最后是篩竇[13]。AFRS患者好發于成年人，男女比例較為接近，主要累及雙側鼻竇或全組發生[10]。本研究中，FB與AFRS的臨床特征與上述文獻報道較為一致。多數患者無基礎性疾病，僅表現為鼻竇真菌感染，這可能與鼻部解剖結構異常有關，鼻腔腫物、鼻中隔偏曲、鼻息肉等均可能造成鼻竇口狹窄、阻塞、通氣不暢，分泌物增多且滯留在竇內使竇腔內環境濕潤，適于真菌生長。

本研究發現CFRS患者真菌和細菌混合感染比例較高,達到49.3%。共分離真菌226株，其中曲霉菌197株，以黃曲霉所占比例最高，其次為煙曲霉，結果與印度、韓國等亞洲國家的相關報道一致，而歐美一些國家報道的煙曲霉分離率高于黃曲霉[10，13-14]。分離得到細菌共345株，主要為凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌目細菌等需氧或兼性厭氧菌，共分離厭氧菌25株。厭氧菌分離率較低，可能與厭氧菌體外培養條件要求更為苛刻，手術獲取的標本量有限以及送檢時長有關。目前關于CFRS患者細菌病原學分布的報道較少。CFRS患者標本的真菌培養陽性率較低，本研究顯示FB患者真菌培養陽性率為65.6%，AFRS患者真菌培養陽性率為36.9%，AFRS患者明顯低于FB患者。目前尚無關于這2種CNIFRS患者病原學比較的文獻報道。CNIFRS患者真菌培養陽性率低的原因分析：(1)無論是FB患者還是AFRS患者，均屬于CNIFRS，真菌在體內可能處于一種生長抑制狀態，因此影響真菌的體外培養；(2)標本量較少，沒有獲取到含有活真菌的標本，尤其是AFRS患者的標本；(3)混合細菌感染，細菌成分影響或抑制真菌的生長[15-17]。

CRS是一種常見的多因素疾病,細菌感染對CRS的發病起著重要作用[13-14]。CFRS臨床上是一種較為獨特的CRS疾病。因此，本研究亦比較了CFRS與非真菌性CRS細菌病原學分布情況。CFRS患者中真菌細菌混合感染患者占27.8%，其病原學分布情況與非真菌性CRS較為接近，均以葡萄球菌屬和腸桿菌目細菌為主。

本研究比較，總結了近5年北京同仁醫院CFRS患者的基本臨床特征和基于傳統培養方法得到的CFRS病原學信息，為CFRS的病因學研究提供了一定的病原學數據。但本研究存在一定的局限性，主要表現在：(1)本研究為單中心的回顧性研究。(2)基于傳統培養方法的病原學研究會受到體外培養條件的限制，本研究中的真菌、厭氧菌等苛養菌的分離率受到了影響。因此，本課題組正在利用基于二代測序技術的宏基因組測序(mNGS)病原學檢測手段對CFRS患者鼻竇手術標本進行微生物組學分析，希望能對CFRS的病原學有更進一步的認識，從而為探討CFRS的病因學和致病機制提供依據。