基因檢測指導耐克拉霉素幽門螺桿菌個體化治療的研究*

尤文佳，何幫順，潘玉琴，孫慧玲，許 桃，王書奎△

1.南京醫科大學附屬南京醫院中心實驗室，江蘇南京 210000；2.江蘇省泰興市人民醫院輸血科，江蘇泰興 225400

幽門螺桿菌(Hp)是一種微需氧的革蘭陰性螺旋桿菌[1]。Hp感染與消化性潰瘍、萎縮性胃炎、黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤及胃癌有密切的關系[2]。Hp的感染具有家族聚集性[3]，根除Hp能有效地阻斷其傳播，防止感染者發展成慢性胃炎，降低消化性潰瘍發病率及復發率，有效緩解MALT淋巴瘤[4]，預防胃癌的發生[5]。然而，隨著藥物根除Hp治療的廣泛應用及抗菌藥物的濫用，Hp耐藥性逐年升高[6]，Hp的根治率在不斷下降。為了調查Hp對克拉霉素的耐藥性，并探究其與耐藥基因檢測的一致性，本研究選用K-B法檢測了Hp對克拉霉素的耐藥性，并選用檢測了這些臨床分離菌株耐藥基因突變狀況。根據藥敏試驗結果進行個體化治療并評價Hp根除情況，可以為耐藥Hp的用藥選擇提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年4月至2018年12月于南京醫科大學附屬南京醫院就診，初始未治療但經13C呼氣試驗檢測為Hp陽性的284例Hp感染病例納入研究(上述病例均在胃鏡室采集過胃組織活檢標本)。從納入研究的病例中隨機抽取222例作為試驗組(將進行克拉霉素藥敏試驗和耐藥基因突變檢測)，其余的62例作為對照組(不進行克拉霉素耐藥的相關檢測)，兩組間年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。排除標準：(1)內鏡檢查證明有活動性出血者；(2)已接受過Hp根除治療的患者；(3)近2周內服用過質子泵抑制劑、H2受體拮抗劑以及近4周內服用過抗菌藥物、鉍劑者；(4)曾對本次醫治所用的藥物有過敏史或皮試陽性者；(5)孕期及哺乳期者；(6)患者同時服用非甾體抗炎藥或酗酒者；(7)存在其他影響本研究結果的嚴重疾病，如嚴重的肝病、心臟病、呼吸系統疾病等。本研究經醫院倫理委員會同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 HF100型三氣培養箱為力康生物醫療科技控股有限公司產品；CX41RF型光學顯微鏡為日本Olympus公司產品；Hp標準株NCTC11637購自上海芯超醫學檢驗所有限公司；HiPure Bacterial DNA Kit試劑盒購自美基生物有限公司；Hp耐藥突變位點檢測試劑盒購自江蘇默樂公司；PCR Mix試劑購自上海翊圣生物科技有限公司；M-H瓊脂培養基(干粉)購自廣東環凱生物公司；腦心浸出液肉湯購自海博生物公司。

1.3方法

1.3.1取樣及培養 在胃鏡下用滅菌活檢鉗夾取距幽門前2～3 cm大彎或小彎處胃黏膜組織，用接種環將組織黏膜連同細菌的混勻營養液均勻接種在分離培養基上。取少量菌液加入快速尿素酶反應管后標注編號，觀察結果后記錄。再將培養基放入培養箱(O2:5%，CO2:10%，溫度：37 ℃)培養3～5 d。取出初代培養成功的菌株進行二代培養，并進行細菌形態(革蘭染色)和生化鑒定(快速尿素酶試驗和氧化酶試驗)。

1.3.2藥敏試驗 取出二代菌的培養基，配制成3×108CFU/mL的菌懸液2份各800 μL。將上述其中1份細菌懸液均分等體積分別均勻涂布于2塊含10%羊血的M-H瓊脂平板培養基上，將克拉霉素藥敏紙片貼于平板(3個/板)，將平板放于培養箱中培養48 h。按照中國藥品生物制品檢驗制訂的抗菌藥物細菌耐藥性檢測中心發布的《抗菌藥物藥敏實驗判定標準》[7]判定抗菌藥物藥敏實驗結果，以克拉霉素最低抑菌濃度≥1 mg/L為耐藥，<1 mg/L為敏感。

1.3.3Hp基因組提取與耐藥基因分析 使用DNA提取試劑盒進行Hp的基因組提取，PCR檢測耐藥突變位點。PCR反應體系：PCR Mix 25 μL，引物(10 μmol/L)5 μL，水10 μL，DNA 10 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；最后72 ℃終延伸5 min。

1.3.4治療 對照組患者及試驗組中經藥敏試驗判定為敏感的患者給予奧美拉唑[20 mg 一日兩次(bid)]+阿莫西林(1 000 mg bid)+克拉霉素(500 mg bid)方案治療；試驗組中經藥敏試驗判定為耐藥的患者給予奧美拉唑(20 mg bid)+阿莫西林(1 000 mg bid)+呋喃唑酮(100 mg bid)+鉍劑方案[6]。連續服藥2周，用藥期間不得服用其他藥物，每日三餐需分餐。停藥4周后經13C呼氣實驗，檢測根除情況。

2 結 果

2.1藥敏試驗和耐藥基因分析 試驗組222例胃黏膜的活檢標本中均分離出Hp菌株，涂片和革蘭染色顯示Hp菌株多呈弧形逗號狀、海鷗形態、短桿彎曲，見圖1。K-B法體外藥敏試驗顯示：敏感155例(69.82%)，耐藥67例(30.18%)。PCR檢測：檢測到Hp對克拉霉素的耐藥基因突變為23S rRNA V區的A2143G和A2142G突變，A2143G突變68例(94.44%)，A2142G突變4例(5.56%)。155例敏感病例中，150例(96.74%)23S rRNA V區無突變，5例(3.26%)23S rRNA V區有突變，67例耐藥病例均為23S rRNA V區突變，見圖2。藥敏試驗與耐藥基因檢測的一致性較好(Kappa=0.023,P=0.609)。

圖1 顯微鏡下觀察Hp革蘭染色形態(×1 000)

注：A為23S rRNA V區突變位點A2143G的檢測；B為23S rRNA V區突變位點A2142G的檢測；M表示分子標準帶；1、2、7、8表示23S rRNA V區無位點突變；3、4表示存在23S rRNA V區A2143G突變(304、101 bp 2條帶)；5、6表示存在23S rRNA V區A2142G突變(332、93 bp 2條帶)。

2.2試驗組中敏感和耐藥患者一般情況比較及各組間Hp根除療效比較 試驗組中的敏感和耐藥患者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。敏感和耐藥患者的Hp根除率均超過86.00%。對照組患者Hp根除率僅為67.74%。試驗組Hp根除率高于對照組(P<0.05)，見表2。

表1 試驗組中耐藥和敏感患者的一般情況比較

表2 各組間Hp根除率比較[n(%)]

3 討 論

根除Hp最好初次治療就選用療效高的方案，由于存在抗菌藥物濫用和治療方案不規范的情況，Hp根除率呈下降趨勢[8-9]。目前，我國治療Hp最常用的抗菌藥物為克拉霉素，但臨床實踐顯示Hp對克拉霉素的耐藥率逐年上升，高達20%～50%[10]，這也是Hp根除率下降的主要原因。有研究報道Hp耐藥菌株感染者的Hp根除率為20%～40%[11]，而理想的治療方案的根除率需要超過90%[12]。在中國，不同地區Hp的耐藥率也有差別[13]。2009—2014年，浙江省嘉興市Hp克拉霉素耐藥率為17.76%[14]。2013—2014年，北京地區Hp克拉霉素耐藥率為52.6%[15]。同時也有研究表明，克拉霉素在首次用藥后，若根除治療失敗極易使細菌產生耐藥性[16]。因此，了解抗菌藥物耐藥情況對Hp根除方案的制訂有著重要的指導作用。

本研究中，對照組62例患者Hp根除率僅有67.74%，與文獻報道基本吻合[17]。本研究采用PCR檢測Hp 23S rRNA V區的克拉霉素耐藥基因突變，結果顯示突變位點有2個，分別為A2143G和A2142G。既往的研究表明，Hp23S rRNA V區域的點突變是導致大環內酯類抗菌藥物耐藥的主要原因，抑制了克拉霉素與相應的核糖體亞基的結合，造成蛋白質合成障礙[18-19]。本研究中的一致性分析顯示：克拉霉素耐藥的藥敏試驗結果與Hp23S rRNA V區基因突變的檢出有高度的一致性；155例敏感患者中有150例(96.74%)23S rRNA V區基因無突變，5例(3.26%)23S rRNA V區基因發生突變；67例耐藥患者均有23S rRNA V區基因突變。仍有克拉霉素敏感的患者檢出23S rRNA V區基因突變，這是否與雜合感染的存在或者是細菌本身存在多種突變相關，仍需要進一步的探討。

將62例未進行藥敏試驗的患者作為對照組，給予奧美拉唑+阿莫西林+克拉霉素治療；222例患者作為試驗組，其中155例敏感患者同樣給予奧美拉唑+阿莫西林+克拉霉素治療，67例耐藥患者給予奧美拉唑+阿莫西林+呋喃唑酮+鉍劑治療。給予連續2周的治療，結果顯示，試驗組患者有較好的Hp根除療效，兩類患者的Hp根除率均超過86%[20]，Hp根除率明顯高于對照組(67.74%)。

本研究中，對耐藥患者直接使用呋喃唑酮進行治療，可提升初次治療的根治率，減少患者無效抗菌藥物使用；對敏感患者使用克林霉素，可避免直接使用更高級的抗菌藥物呋喃唑酮，減少臨床抗菌藥物濫用。對于存在Hp感染的患者，先進行藥敏試驗或耐藥基因檢測，然后制訂個體化的治療方案，可以達到精準給藥的目的，提高Hp的根除率，減少抗菌藥物濫用。

綜上所述，本研究發現Hp對一線治療藥物克拉霉素存在耐藥情況，應結合藥敏試驗和耐藥基因突變檢測進行針對性地治療，有效根除Hp。