環狀RNA circCDYL對肝細胞癌遷移和侵襲的影響

王海雨，王 然

南京醫科大學附屬淮安第一醫院醫學檢驗中心，江蘇淮安 223001

超過90%的人類轉錄體不具備蛋白質編碼能力，但可以轉錄為非編碼RNA(ncRNA)，包括微小RNA(miRNA)，長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環狀RNA(circRNA)[1]。circRNA由前體mRNA反向剪接而成，具有環形共價閉合結構，對核酸外切酶的耐受性更高，因而具有更高的穩定性[2]。研究人員已在各種生物體中鑒定出數千種circRNAs，它們在許多疾病(尤其是各類癌癥)中起到了關鍵作用[3-6]。circRNA通過與miRNA結合充當“miRNA海綿”，通過影響其對目的轉錄體的降解發揮間接調控的作用。轉錄組數據分析發現：環狀Y樣結構域(circCDYL)與RNA結合蛋白(RBP)的相互作用促進膀胱癌細胞的增殖和轉移，且與患者的不良預后相關[7-8]。目前關于circCDYL在肝細胞癌(HCC)中的作用尚未完全闡明，故本研究探討了HCC組織及癌旁組織中circCDYL的表達差異，同時分析了HCC組織中circCDYL的表達與患者臨床資料的關系及對預后的影響，運用體外細胞實驗驗證了circCDYL對HCC遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1標本及細胞系來源 cDNA芯片(包括90對HCC組織和癌旁組織標本提取RNA后逆轉錄為cDNA)由芯超生物科技有限公司提供，包括完整的臨床/病理參數及隨訪資料，手術時間從2007年6月至2008年11月，隨訪截至2012年3月，隨訪期間死于HCC的患者32例，患者術前均未接受任何治療。4株HCC細胞(HepG2、QGY-7703、MHCC97-H、SMMC-7721)和1株正常肝臟上皮細胞(LO2)由中科院生物化學研究所(上海)提供，細胞在含有10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養基、37 ℃、5% CO2孵育箱中培養。

1.2方法

1.2.1circCDYL表達水平檢測 使用總RNA抽提試劑提取HCC細胞株及正常肝臟上皮細胞的RNA，之后逆轉錄為cDNA。使用qPCR試劑在伯樂T100 PCR儀上檢測細胞株和芯片中circCDYL表達水平。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為circCDYL的內參，測得circCDYL與GAPDH的閾值循環數(Ct)，運用2—ΔΔCt公式計算circCDYL的相對表達量。以上檢測重復5次。將90例HCC組織按circCDYL相對表達水平排序，低于中位數定義為circCDYL低表達組，高于中位數則定義為circCDYL高表達組。

1.2.2細胞轉染 敲減circCDYL的3條小干擾RNA(siRNA)由吉凱基因有限公司(上海)提供。將4×105個細胞均勻鋪在6孔板中孵育，當細胞密度達到60%～70%時，轉染siRNA和陰性對照序列，孵育48～72 h后收集細胞并提取RNA，檢測circCDYL的敲減效率。circCDYL、GAPDH引物及siRNA寡核苷酸序列見表1。

表1 實驗所用引物及siRNA寡核苷酸序列

1.2.3細胞遷移及侵襲實驗 使用無血清DMEM培養基調整細胞密度約5×105～6×105個/mL，吸取300 μL懸液加入上層小室中(侵襲實驗在遷移實驗基礎上多鋪一層凝膠)，加入500 μL 10% FBS培養液在下層小室；孵育24 h，將未通過孔篩的細胞拭去，而將通過孔篩的細胞使用甲醛固定、結晶紫染色，在普通光學顯微鏡下計數。

2 結 果

2.1HCC組織與癌旁組織中circCDYL表達水平的比較 HCC組織中circCDYL相對表達水平(4.01±1.63)高于癌旁正常組織(0.74±0.21)，差異有統計學意義(t=17.37,P<0.05)。

2.2HCC組織中circCDYL相對表達水平與患者臨床/病理參數的關聯性 HCC組織中circCDYL表達與HBsAg狀態、血管浸潤、肝硬化結節個數、淋巴結轉移、TNM分期、復發情況、PD-L1和CTLA-4狀態有關聯，差異均有統計學意義(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤最大徑及血清AFP水平等均無關聯(P>0.05)，見表2。

表2 HCC組織中circCDYL的相對表達水平與患者臨床/病理參數的關聯性[n(%)]

續表2 HCC組織中circCDYL的相對表達水平與患者臨床/病理參數的關聯性[n(%)]

2.3circCDYL對HCC細胞系遷移和侵襲能力的影響 對4株HCC細胞(HepG2、QGY-7703、MHCC97-H、SMMC-7721)和1株正常肝臟上皮細胞(LO2)中circCDYL表達進行檢測，結果發現4株HCC細胞中circCDYL相對表達水平(4.50±0.30、2.93±0.21、2.37±0.15、1.60±0.10)均高于正常肝臟上皮細胞(1.00±0.20)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1A。選取HepG2轉染3個siRNA用以敲減circCDYL，其中siRNA-1效果最顯著(P<0.001)，見圖1B。選擇siRNA-1轉染的細胞進行后續遷移、侵襲實驗，敲減circCDYL后，HepG2細胞的遷移和侵襲能力均下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：A為4種HCC細胞與正常肝臟上皮細胞(LO2)中circCDYL相對表達水平比較；B為HepG2細胞系轉染siRNA后敲減效果的比較；***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

注：A、C表示HepG2細胞轉染siRNA-1后遷移能力明顯下降；B、D表示HepG2細胞轉染siRNA-1后侵襲能力明顯下降；***表示P<0.001；si-NC為對照；si-circCDYL為采用siRNA-1敲減circCDYL；放大倍數為100。

2.4circCDYL相對表達水平與HCC患者預后之間的關聯性 經生存分析，對TNMⅠ～Ⅲ期(作為整體)、Ⅰ期、Ⅱ期的HCC患者分別進行生存分析，circCDYL高表達患者總體生存率均低于低表達患者，差異具有統計學意義(Log-rankχ2=52.06、30.65、15.49，P<0.05)；circCDYL高表達患者無復發生存率均低于低表達組，差異有統計學意義(Log-rankχ2=38.24、28.13、7.63，P<0.05)；見圖3。Cox比例風險模型探討影響HCC患者不良預后的暴露因素，發現circCDYL高表達是HCC患者不良預后的獨立危險因素(HR=22.712，P<0.05)，見表3。

注：A、D為對80例TNMⅠ～Ⅲ期HCC患者進行的評估；B、E為對39例TNMⅡ期患者進行的評估；E、F為對36例Ⅲ期患者進行的評估。

表3 Cox回歸分析影響HCC患者預后的因素

續表3 影響HCC患者預后的暴露因素相關Cox回歸分析

3 討 論

本研究發現，HCC組織中circCDYL相對表達水平顯著高于癌旁組織，這表明circCDYL可能參與了HCC的發生，其異常表達可能促進肝臟正常上皮細胞過度增殖，其長期作用會促進腫瘤形成。腫瘤細胞發生轉移一般先侵襲上皮細胞基底面的附著層或微血管，再經過淋巴循環或血循環形成遠處轉移，因此腫瘤細胞亞型是否具有侵襲性、有無局部淋巴結轉移或血管浸潤對預后判斷起到十分關鍵的作用[9-12]。進一步分析發現：circCDYL表達與淋巴結轉移和局部血管浸潤有關；體外遷移和侵襲實驗驗證circCDYL能促進HCC細胞的遷移和侵襲，提示circCDYL可能有促進腫瘤細胞發生局部侵襲及遠處轉移的作用，同時circCDYL表達水平與患者TNM分期及復發情況也有關。TNM分期和復發是反映腫瘤進展的重要指標，TNM分期越高，患者預后往往不佳[13-14]，治療后腫瘤復發往往會導致患者的生存期大幅縮短，對患者的預后有十分不利的影響[15-16]，以上結果提示circCDYL與HCC的發展密切相關。circCDYL的表達與PD-L1和CTLA-4呈陽性有關，PD-L1和CTLA-4是腫瘤逃脫免疫監視和清除的重要分子，目前新興腫瘤治療的靶點多針對PD-L1和CTLA-4[17-18]，提示circCDYL可能通過促進PD-L1和CTLA-4表達促進HCC發生、發展，該推論需要進一步的機制研究來驗證。既往研究表明，circCDYL具有促進套細胞淋巴瘤細胞增殖的功能[19]；但本研究發現circCDYL表達與腫瘤最大徑無關，推測circCDYL與HCC細胞增殖無關，這種差異可能由于組織特異性造成的。

本研究針對不同TNM分期的HCC患者進行分析，發現circCDYL高表達者的總體生存率和無復發生存率均低于低表達者，同時多因素回歸分析發現HCC組織中circCDYL高表達是促進患者不良預后的獨立危險因素。以上結果提示circCDYL對HCC患者預后判斷可能具有一定價值，其高表達提示HCC患者預后不良。

綜上所述，circCDYL在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，其可能促進了HCC細胞的遷移和侵襲，后期仍需體內實驗的進一步驗證。其高表達提示HCC患者預后不良，有望成為新的診斷和預后標志物。