RNF5介導JAMP泛素化促進內質網應激和細胞凋亡參與妊娠期糖尿病發展的機制研究*

丁轉南，黃麗珊，歐宜靜，黃素然，黃 文△，禤文婷

南方醫科大學附屬東莞醫院：1.婦產科；2.內分泌科，廣東東莞 523000

妊娠期糖尿病(GDM)是婦女在妊娠期出現的糖尿病，全球發病率約占妊娠婦女總數的17.8%[1]。GDM會增加妊娠期其他并發癥的發病風險，同時還可能增加胎兒死亡、生長受限的風險，因此需要對GDM采取積極干預措施，以免給母嬰帶來不良后果[2-3]。GDM是一種機制復雜的疾病，涉及胰島B細胞衰竭、胰島素抵抗、氧化應激與機體炎癥等多種病理因素[3]。越來越多的研究表明，這些病理因素存在密切關聯，即都可能來自于內質網應激[4-6]。高血糖會干擾內質網的蛋白質折疊和運輸功能，這導致多肽在內質網中積累，并損害胰島素的分泌。環指蛋白5(RNF5)是E3泛素蛋白連接酶，主要存在于內質網與線粒體中，在腦、心、肝、胎盤、胰腺等多種人體組織中均有表達[7]。JNK相關膜蛋白(JAMP)是一種將蛋白質招募到內質網的蛋白，近年來國外多項研究均報道了RNF5能將JAMP泛素化使其無法完成蛋白體招募和降解工作[8-10]。在錯誤折疊蛋白質無法完成降解清除而大量積累，會誘發內質網應激反應[11]。因此推測RNF5可能是通過介導JAMP泛素化而促進內質網應激，從而參與GDM發展，但目前國內外研究中仍無此方向的報道，于是本研究設計了從臨床組織標本到體外細胞培養與動物模型實驗，旨在探討GDM中RNF5與內質網應激的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1臨床標本 收集2018年1月至2021年4月于本院行剖宮產的109例GDM產婦的胎盤組織標本作為GDM組。所有產婦均符合GDM的診斷標準[12]，經75 g糖耐量實驗測定2 h血清葡萄糖水平>9.0 mmol/L；所有產婦均為單胎妊娠、凝血功能均正常；排除合并遺傳性疾病、其他器質性疾病者及腫瘤患者。另外，收集同期的83例健康產婦胎盤組織標本作為對照組。本研究經本院倫理委員會審批，且所有納入研究的產婦均對本研究知情同意。本研究中，GDM產婦年齡為(27.32±4.29)歲，平均分娩孕周為(39.32±2.69)周；健康產婦年齡為(27.18±4.52)歲，平均分娩孕周為(39.72±2.33)周。GDM產婦和健康產婦年齡、分娩孕周比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2細胞與實驗動物 人妊娠絨毛膜癌細胞系BeWo(貨號：CL-0500)與人胚腎細胞HEK-293(貨號：CL-0001)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，采用MEM培養基(添加10%胎牛血清和1%鏈霉素/青霉素)培養，置于5%CO2、37 ℃條件下培養。SPF級Balb/c小鼠36只購自南方醫科大學實驗動物中心，其中雌性24只，雄性12只，6～8周齡，體重為(24.15±2.62)kg，雌雄比例為2∶1。合籠飼養，每日早晨檢查雌鼠陰栓，出現陰栓立即進行陰超檢查，將7 d內出現妊娠癥狀的小鼠作為實驗對象(本研究得到了15只)。動物的飼養與處理均符合實驗動物倫理學要求。

1.3方法

1.3.1蛋白免疫印跡法檢測蛋白水平 將組織標本/細胞裂解后，提取總蛋白，BCA試劑盒對總蛋白質進行定量，經電泳、轉膜、封閉、抗體孵育后，采用ECL化學發光試劑盒進行顯色，凝膠成像分析儀拍照后計算蛋白相對表達水平。檢測的蛋白包括內質網應激標志分子：X盒結合蛋白1(XBP-1)、磷酸化真核翻譯起始因子2α(p-eIF2α)、真核翻譯起始因子2α(eIF2α)、C/EBP同源蛋白(CHOP)，以及RNF5。

1.3.2GDM模型細胞構建 采用體外高糖刺激BeWo細胞來模擬GDM胎盤組織細胞，在體外構建GDM模型細胞。將對數生長期的BeWo細胞分為正常對照組、模型對照組、siRNA-NC組、siRNA-RNF5組。正常對照組在葡萄糖濃度為5 mmol/L的培養基中培養。其余3組均采用葡萄糖濃度為25 mmol/L的培養基進行培養；其中，模型對照組不進行轉染；siRNA-NC和siRNA-RNF5組在培養24 h后進行轉染：采用Lipofectamin2000轉染試劑盒，將50 nmol/L siRNA-NC、siRNA-RNF5(由上海吉瑪制藥公司合成)分別轉染至對數生長期的siRNA-NC組、siRNA-RNF5組細胞。

1.3.3細胞活力與凋亡檢測 將細胞接種于96孔板，繼續培養48 h，CCK-8法測定細胞活力，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長的吸光度(A)值，計算細胞活力；采用Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒測定細胞凋亡率，取100 μL細胞懸液和Annexin-V-FITC、PI于黑暗環境下孵育15 min后，采用流式細胞儀進行檢測。

1.3.4體外泛素化實驗 將FLAG-JAMP和siRNA-CN(或siRNA-RFN5)轉染至HEK 293細胞，對照組細胞不進行轉染。細胞轉染42 h后加入泛素蛋白酶抑制劑MG132，孵育6 h后收集細胞，加入500 μL細胞裂解液于4 ℃裂解后取上清液，留取40 μL作為Input標本，剩余部分加入20 μL 抗-FLAG磁珠于4 ℃過夜，低速離心棄上清，再加入1 mL細胞裂解液4 ℃低速離心棄上清，重復幾次后煮沸取上清液進行電泳，采用蛋白免疫印跡法檢測蛋白質，方法同1.3.1。

1.3.5構建GDM模型小鼠 將15只孕鼠單籠喂養，3只作為正常對照組，其余12只用于構建GDM模型。GDM模型小鼠在禁食12 h后，經腹腔注射鏈脲佐菌素(湖南匯百侍生物科技有限公式，批準文號：國藥準字H20020475)50 mg/kg，正常對照組則注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液，4 h后開放進食與飲水。7 d后進行2 g/kg的口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，并檢測空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)水平，計算穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。將FBG≥5.1 mmol/L，且FINS、HOMA-IR均升高，則表示GDM模型構建成功。

1.3.6siRNA-RFN5干預GDM模型小鼠 將成功構建GDM模型的9只小鼠平均分為3組(每組3只)，分別作為模型對照組、siRNA-NC組與siRNA-RFN5組。分別將20 μg siRNA-NC、siRNA-RFN5溶于2.5 mL生理鹽水中，經尾靜脈分別注射入siRNA-NC組與siRNA-RFN5組小鼠，模型對照組則注射等體積生理鹽水，干預4周。在干預期間檢測和記錄小鼠體重、FBG、FINS水平并計算HOMA-IR。在干預4周后處死小鼠，取出胎盤組織，檢測RNF5與內質網應激分子的表達情況。

2 結 果

2.1兩組胎盤組織中RNF5的表達情況比較 GDM組RNF5相對表達水平高于對照組(0.25±0.09vs.0.12±0.05，t=9.616,P<0.001)，見圖1。

注：Normal表示對照組；GDM表示GDM組。

2.2胎盤組織中內質網應激標志分子水平及其與RNF5表達的關系 GDM組XBP-1、CHOP相對表達水平和p-eIF2α/eIF2α均高于對照組(1.35±0.47vs.0.48±0.12、0.81±0.33vs.0.41±0.18、0.81±0.18vs.0.42±0.11，t=15.55、10.00、10.94，P<0.01)，見圖2。對GDM組上述應激標志水平與RNF5蛋白相對表達量進行相關性分析發現，RNF5相對表達水平與XBP-1、p-eIF2α/eIF2α、CHOP均呈正相關(r=0.300、0.450、0.229，P<0.05)。

2.3下調RNF5表達對高糖環境下BeWo細胞內質網應激與細胞凋亡的影響 模型對照組、siRNA-NC組RNF5表達水平較高于正常對照組，且伴隨著內質網應激標志(XBP-1、CHOP、p-eIF2α/eIF2α)水平的升高，而下調了RNF5表達的iRNA-RNF5組細胞上述內質網應激標志水平降低，見圖3。體外泛素化實驗結果顯示，下調RNF5表達減輕了JAMP泛素化程度，見圖4。此外CCK8法測得模型對照組較正常對照組活力降低(0.72±0.05vs.1.253±0.10，t=8.499，P=0.001)，細胞凋亡率升高[(13.32±0.74)%vs.(1.24±0.06)%，t=28.28，P<0.001)]，而iRNA-RNF5組(下調RNF5表達)較siRNA-NC組細胞活力更高(0.97±0.04vs.0.67±0.05，t=7.48，P=0.002)，凋亡率降低[(6.72±0.68)%vs.(14.58±1.25)%，t=9.540，P<0.001)]，見圖5。以上結果提示，在GDM細胞模型中RNF5通過介導JAMP泛素化誘發了內質網應激和細胞凋亡。

注：Normal表示對照組；GDM表示GDM組。

注：Control表示正常對照組；Model表示模型對照組；siRNA-NC表示siRNA-NC組；siRNA-RFN5表示siRNA-RFN5組。

注：Control表示對照組；siRNA-NC表示轉染siRNA-NC的細胞；siRNA-RFN5表示轉染siRNA-RFN5的細胞；IP表示免疫沉淀；IB表示免疫印跡；UBI表示泛素。

注：Control表示正常對照組；Model表示模型對照組；siRNA-NC表示siRNA-NC組；siRNA-RFN5表示siRNA-RFN5組。

2.4下調RNF5表達對GDM模型小鼠胰島素抵抗與內質網應激的影響 GDM模型建立2、4周時，模型對照組小鼠體重均低于正常對照組小鼠(28.04±0.07vs.32.16±0.41、31.00±0.66vs.37.93±0.30，t=17.157、16.556，P<0.001)；而0、2周與4周的FBG水平高于正常對照組[(15.53±0.53)mmol/Lvs.(5.02±0.10)mmol/L、(16.02±0.27)mmol/Lvs.(5.12±0.04)mmol/L、(16.10±0.70)vs.(5.09±0.27)mmol/L，t=33.751、69.169、25.417，P<0.001)]，HOMA-IR也高于正常對照組(5.80±0.37vs.2.07±0.21、6.33±0.29vs.2.14±0.24、7.12±0.17vs.2.02±0.19，t=15.186、19.279、34.648，P<0.001)。在siRNA-RNF5干預2、4周時，siRNA-RNF組小鼠體重高于siRNA-NC組[(27.90±0.26)gvs.(31.01±0.24)g、(31.31±0.40)gvs.(36.84±0.32)g，t=15.224、18.698，P<0.001]，小鼠FBG水平[(12.90±0.29)mmol/Lvs.(16.18±0.43)mmol/L，(9.33±0.21)mmol/Lvs.(16.11±0.20)mmol/L，t=10.954、40.494，P<0.001]與HOMA-IR(4.54±0.16vs.6.38±0.33，3.71±0.13vs.7.11±0.23，t=8.690、22.290，P<0.001)也高于siRNA-NC組。GDM模型對照組小鼠胎盤組織內RNF5表達水平升高，伴隨著內質網應激標志分子表達的增強，而當siRNA-RNF5干預4周后，小鼠胎盤組織中RNF5水平與內質網應激標志水平均降低，見圖6。以上結果提示下調RNF5表達可減輕GDM模型小鼠胰島素抵抗與胎盤內的內質網應激。

注：Control表示正常對照組；Model表示模型對照組；siRNA-NC表示siRNA-NC組；siRNA-RFN5表示siRNA-RFN5組。

3 討 論

胎盤是分泌多肽較多的器官，容易受到內質網應激的影響，在內質網應激狀態下胎盤功能失調，可能會改變母體新陳代謝的平衡，并導致GDM。國外研究已證明了胎盤內質網應激在妊娠并發癥的病理生理學中的核心作用[13]。

本研究觀察到，與正常產婦胎盤組織相比，GDM產婦胎盤組織中RNF5呈高表達，同時伴隨著內質網應激標志水平的升高，且RNF5與內質網應激標志水平呈正相關，提示RNF5可能通過誘發內質網應激來促進GDM發展。在細胞受到高糖環境刺激時，內質網形態和功能受破壞，蛋白質加工和運輸受阻，使得內質網積累了大量錯折疊或未折疊蛋白，引發細胞采取一系列應答措施來緩解內質網壓力，促進內質網功能恢復[14-15]。而由錯誤折疊或未折疊蛋白質在內質網腔內大量積累會引發一系列反應，是糖尿病發生的重要病理機制[16-17]。在發生內質網應激時，作為內質網傳感器的XBP-1表達上調，XBP-1是一種轉錄活化因子，誘發細胞內未折疊蛋白反應(UPR)，從而引發下游eIF2α磷酸化成為p-eIF2α并失活，促使胞內蛋白質合成終止，同時引起促凋亡分子CHOP表達增加[18-20]。

體外細胞實驗證明，高糖環境刺激BeWo細胞會導致RNF5與內質網應激標志水平升高、細胞凋亡率升高、細胞活力降低，而下調RNF5能通過減輕JAMP泛素化降低高糖環境下的BeWo細胞內的內質網應激標志水平，同時減少細胞凋亡，增強細胞活力。JAMP是錨定在內質網膜上的一種跨膜蛋白，是多種蛋白復合體中的重要組件，可促進內質網內的錯誤折疊蛋白的清除；RNF5作為泛素化連接酶，介導了JAMP的泛素化，但是不影響JAMP的穩定性[8,10]。而JAMP泛素化后無法再組裝內質網相關降解的蛋白復合體，導致內質網功能的失調，進而誘發了內質網應激，促進了細胞凋亡[11]。

隨后的研究探討了下調RNF5是否在體內也能緩解內質網應激從而改善GDM癥狀，結果顯示下調RNF5表達可減輕GDM模型小鼠胰島素抵抗癥狀，同時可降低胎盤內的內質網應激分子表達水平。既往LIONG等[21]學者研究中對GDM模型采用內質網應激抑制劑來進行干預，發現GDM模型中的胰島素抵抗得到了改善，明確證實了內質網應激在GDM發病中的重要作用。結合此文獻結果，本研究可基本確定RNF5是通過誘導內質網應激與細胞凋亡來促進GDM進展的。

綜上所述，GDM產婦胎盤組織中RNF5表達水平存在異常升高，高RNF5水平通過泛素化JAMP誘發內質網應激與細胞凋亡，從而促進了GDM的發展，而下調RNF5表達水平可以逆轉此過程，從而抑制GDM的進展。