基于表面自聚合的多功能納米探針制備及性能研究

湯 雯，邊 靜

(四川省科學城醫院，四川 成都 610000)

光熱治療是目前治療腫瘤最有效的一種醫學手段，通過光熱探針產生局部高溫，殺死病灶處腫瘤細胞。在光熱治療中引入成像技術可以有效提高治療的精準性。但傳統常用納米探針無法實現核磁共振成型，因此多模式成像功能的納米光熱探針的合成是目前研究的重點。對此，我國很多學者也作出了一些研究，針對TME響應的19F-MR納米分子成像探針進行深入研究，證實19F-MR納米探針在特定條件下，可在分子水平早期可視化TME中的惡性生物學行為，為實現腫瘤早期診斷及精準治療提供有利支持；用線粒體作為線粒體靶向AIE探針區分癌細胞與正常細胞的靶標，使得聚集誘導發光探針能對癌癥細胞進行準確診斷；通過水熱法合成熒光生物質碳點BCDs，并將其應用到細胞成像中；但在納米探針成像方面還存在不足。基于此，本文用表面自聚合方法合成釓離子修飾的硫化鉍@聚多巴胺(BiS@PDA-Gd)復合納米探針。設計試驗證實BiS@PDA-Gd納米探針能夠為腫瘤診斷及治療都提供了更精準的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

本試驗主要材料：聚乙烯吡咯烷酮(PVP，山東豪順化工有限公司，AR)、硫代乙酰胺(TAA，山東豪順化工有限公司，AR)、甘露醇(AR，山東富禾生物科技有限公司)、硫代乙酰胺(AR，山東豪順化工有限公司)、三(羥甲基)氨基甲烷(BR，濟南匯錦川化工有限公司)、六水合氯化鐵(AR，山東力昂新材料科技有限公司)、鹽酸多巴胺(98%，西安澤朗生物科技有限公司)、六水合氯化釓(99.9%，山東力昂新材料科技有限公司)、超純水(18 MΩ/cm，上海景純水處理技術有限公司)。

本試驗主要設備：精密電子天平(H0503，河北德科機械科技有限公司)、高速離心機(TG16KR，上海繼譜電子科技有限公司)、紫外/可見光分光光度計(U-T6，屹譜儀器制造(上海)有限公司)、激光粒度儀(LS-POP(9)，珠海市歐美克儀器有限公司)、光學成像儀(Nexus 128，廣州云星科學儀器有限公司)、臨床前緊湊型磁共振成像儀(uMR 560，上海聯影醫療科技有限公司)。

1.2 試驗方法

..BiS納米顆粒的合成

(1)在25 mL純水中溶入1 g PVP，攪拌均勻后加入甘露醇0.227 5 g和Bi(NO)·5HO，充分攪拌使其完全溶解；

(2)用H0503型精密電子天平精準稱取TAA 0.028 g，放入10 mL超純水中，充分攪拌溶液；

(3)將以上步驟溶液混合，緩慢提升反應溫度使其充分反應，反應溫度和時間分別為100 ℃和1 h；

(4)取出反應產物，然后置于TG16KR型高速離心機中洗滌3次，離心轉速和每次清洗時間分別為10 000 r/min和10 min。然后將洗滌后產物放入體積一定的超純水中，攪拌使其充分溶解，配制成質量濃度為1 mg/mL的BiS溶液備用。

..BiS@PDA鈉米顆粒的合成

(1)用H0503型精密電子天平分別精準稱取4.5 mg鹽酸多巴胺、6.2 mg FeCl·6HO，然后依次放入130 mL超純水中，攪拌使其充分溶解。然后加入6 mL“1.2.1”配制的1 mg/mL BiS溶液，攪拌使其充分反應，攪拌時間為1 h；

(2)用電子天平金精準稱取450 mg三氨基甲烷，放入20 mL超純水中，攪拌使其充分溶解。配制成為pH值為9.6左右的Tris緩沖液；

(3)將以上兩個步驟溶液混合，在室溫條件下充分攪拌，攪拌時間為2 h；

(4)將反應產物置于高速離心機中，在10r/min轉速下離心洗滌3次，每次洗滌時間為10 min。然后溶解于體積一定的超純水中，配制成1 mg/mL的 BiS@PDA溶液備用。

..BiS@PDA-Gd鈉米顆粒的合成

(1)將濃度為0.1 mol/L的GdCl溶液100 μL，倒入10 mL質量濃度為1 mg/mL的 BiS@PDA溶液中，攪拌使其混合均勻，攪拌時間為1 h；

(2)將產物置于高速離心機中，在10r/min轉速下離心洗滌2次，然后溶于體積一定的超純水中備用。

1.3 Bi2S3@PDA-Gd3+表征

..紫外可見光吸收

用U-T6型紫外/可見光分光光度計測定BiS和BiS@PDA的紫外-可見光吸收。

..Zeta 電位

用LS-POP(9)型激光粒度儀測定 BiS@PDA和BiS@PDA-Gd的Zeta 電位和水合粒徑分布。

1.4 Bi2S3@PDA-Gd3+應用

體外光生成像試驗

(1)分別取質量濃度為1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/mL的BiS@PDA-Gd溶液各200 μL，將其放入200 μL的PCR管中，超純水為空白對照組；

(2)用Nexus 128學成像儀，在800 nm 近紅外脈沖激光條件下進行光生信號測試。

..體外磁共振T1成像試驗

(1)分別取質量濃度為400、200、100、50、25、12.5和6.25 mg/mL的BiS@PDA-Gd溶液各200 μL。放入200 μL的PCR管中，超純水為空白對照組；

(2)用uMR 560型臨床前緊湊型磁共振成像儀進行磁共振成像試驗。

1.5 動物試驗

體內光學成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射質量濃度為10 mg/mL的BiS@PDA-Gd的PBS溶液200 μL。然后分別在注射0、2、4、8、24 h后，對Hela 荷瘤裸鼠用800 nm 近紅外脈沖激光進行光聲成像。

..體內磁共振T1成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射質量濃度為10 mg/mL的BiS@PDA-Gd的PBS溶液200 μL。然后分別在注射0、4、8、24 h后，對Hela 荷瘤裸鼠在T1磁場中進行磁共振成像試驗。試驗時，TR和TE分別為446 ms和15 ms。

2 結果與討論

2.1 Bi2S3@PDA-Gd3+表征分析

..紫外可見光吸收表征

圖1為BiS和BiS@PDA的紫外-可見光吸收圖，插圖a、b分別為BiS和BiS@PDA的水溶液圖。

由圖1可知，BiS溶液表現為棕黃色；而BiS@PDA的顏色則表現藍黑色。觀察圖中曲線可知，BiS在近紅外區域吸收較弱；BiS@PDA在近紅外區域吸收明顯的增加，且在650 nm左右出現明顯吸收峰。研究發現，堿性條件下，用Fe合成的PDA會在710 nm左右出現吸收峰。因此初步判定，BiS和PDA成功復合，且BiS對PDA吸收峰產生影響，使其出現藍移的現象。

圖1 Bi2S3和Bi2S3@PDA的紫外-可見光吸收圖

..粒徑分布和Zeta電位

圖2、圖3分別為BiS、BiS@PDA的粒徑分布圖和BiS、BiS@PDA、BiS@PDA-Gd的Zeta電位圖。

圖2 Bi2S3、Bi2S3@PDA的粒徑分布圖

圖3 Bi2S3、Bi2S3@PDA、Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta電位圖

由圖2、圖3可知，BiS的平均粒徑比BiS@PDA的平均粒徑低40 nm左右。BiSNPs的Zeta電位為-11.65 mV；BiS@PDANPs的Zeta電位為-31.89 mV、BiS@PDA-GdNPs的Zeta電位為-19.54 mV；BiS@PDANPs的Zeta電位遠高于BiSNPs的Zeta電位。這是因為在 BiS外包覆著一層PDA，PDA表面具有豐富的—OH，使得BiS@PDANPs表現出較強負電。而BiS@PDA-Gd的Zeta電位低于BiS@PDA，這是因為和Gd螯合的過程中，PDA表面的—OH被消耗掉一部分，因此BiS@PDA-GdZeta電位相對降低。這也就說明了BiSNPs，PDA 層和 Gd成功復合。

2.2 Bi2S3@PDA-Gd3+應用

體外光生成像

不同質量濃度的BiS@PDA-Gd光學信號強度及其關系，具體如圖4所示。

圖4 不同質量濃度的Bi2S3@PDA-Gd3+光學信號強度及其關系

由圖4可知，光學信號隨BiS@PDA-Gd納米材料質量濃度的增加逐漸增加，證實BiS@PDA-Gd納米材料與光學強度間表現出線性關系。同時，也說明了該復合材料的分散性較好，能夠用于體內光生成像。

..體外T磁共振成像

不同濃度的BiS@PDA-GdT1磁共振成像及其關系，結果如圖5所示。

由圖5可知，BiS@PDA-Gd納米材料在T1模式下表現出優良成像效果，且成像亮度隨BiS@PDA-Gd濃度的增加而逐漸增強；弛豫效率=12.04(mmol/L)·s。這就證實了Gd離子成功螯合在PDA層上，使其成為了優秀的T1造影劑。

圖5 不同濃度的Bi2S3@PDA-Gd3+T1磁共振成像及其關系

2.3 動物試驗

體內光聲成像

圖6為注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液后，不同時間腫瘤位置的光聲成像結果。

圖6 注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同時間腫瘤位置的光聲成像結果

由圖6可知，在2 h時，腫瘤部位有光生信號，光聲強度大概為330.369 a.u.；在8 h時，光聲信號達到最高，此時強度值大概為490.424 a.u.。隨注射時間的增加，腫瘤部位的光聲信號雖然有所減弱，但仍舊具備良好的光聲信號。當注射時間為24 h時，光聲強度值為412.059 a.u;這就說明，BiS@PDA-Gd納米材料在體內光聲成像仍舊表現良好，可用于體內光聲成像。

..體內T1磁共振成像

圖7為在T1模式下，注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液后不同時間腫瘤位置的磁共振圖像。

圖7 T1模式下注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同時間腫瘤位置的磁共振圖像

由圖7可知，T1模式下，注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液4 h后，體內循環使得BiS@PDA-Gd在腫瘤位置處富集，使得該處亮度明顯增加，進而幫助確定腫瘤的位置；當注射時間超過4 h，成像效果基本未發生改變。這就說明BiS@PDA-Gd納米材料能夠通過小鼠自身循環系統在腫瘤位置富集，且成像較為明顯，能夠成為新一代T1模式磁共振造影劑。

綜合光聲成像和T1磁共振成像結果，證實BiS@PDA-Gd納米探針能夠為腫瘤診斷及治療都提供了更精準的技術手段。

3 結語

本文以表面自聚合方法，通過PDA的表面聚合，使其包覆BiS，得到BiS@PDA納米材料。然后利用PDA表面的—OH，與具有MRI性能的Gd金屬離子進行螯合，得到BiS@PDA-Gd復合納米探針。通過體內外光聲試驗和T1磁共振試驗對其性能進行表征，得到具體結論。

(1)UV-vis和Zeta電位結果表明，BiS@PDA比BiS的近紅外區域吸收更強，且在650 nm左右出現了明顯吸收峰。BiS@PDA的Zeta電位為-31.89 mV，明顯高于BiS-11.65 mV，證實BiS與 PDA復合成功；而BiS@PDA-Gd的Zeta電位為-19.54 mV，明顯低于BiS@PDA的Zeta電位。說明螯合后，Gd離子消耗掉PDA表面—OH，表明BiS、PDA和Gd離子復合成功；

(2)體外光聲試驗和體外T1磁共振試驗結果表明，光聲信號強度和T1磁共振強度與BiS@PDA-Gd濃度表現出線性關系。這就說明了BiS@PDA-Gd納米材料具有良好的分散性，可成為優秀的T1造影劑；

(3)體內光聲試驗和體內T1磁共振試驗結果表明，小鼠尾部靜脈注射BiS@PDA-Gd8 h后，光聲強度值最高為490.424 a.u.；注射時間為24 h時，BiS@PDA-Gd仍具備良好的光聲信號。在T1模式下，注射4 h，BiS@PDA-Gd在腫瘤處富集，增加腫瘤明亮度，幫助確定腫瘤的位置；超過4 h后，成像效果改變不明顯，證實BiS@PDA-Gd納米探針能夠成為新一代T1模式磁共振造影劑。