低共熔溶劑提取厚樸渣中木脂素類化合物

王 帆，簡雅婷，張 宇，陳小燕，余 強

（1. 中國科學院廣州能源研究所，廣州 510640； 2. 中國科學院大學，北京 100039； 3.中國科學技術大學，合肥230000； 4.華南農業大學生物質工程研究院，農業農村部能源植物資源與利用重點實驗室，廣東省農林生物質工程技術研究中心，廣州 510642）

0 引 言

近年來，隨著國內外依賴中藥和天然藥物資源為原料的大健康產業迅猛發展，藥渣產生量劇增，但由于提取工藝、設備和管理因素的制約，藥渣等廢棄物未能得到有效利用，不僅造成資源浪費，且導致生態環境的嚴重污染。Li等對黃芪廢渣成分進行了鑒定，劉常青等比較了丹參藥材與丹參藥渣中丹參酮ⅡA的含量，Biltekin檢測了橄欖渣中存在的一些有價值的生物活性化合物，在最佳條件下獲得的山楂酸和齊墩果酸總量為26 mg/g干物質，相當于提取物的98.21%。以上結果均說明中藥渣仍有較大的再利用價值。通常中藥的提取溶媒為水溶液，其藥渣中還殘存有大量的脂溶性成分，資源的浪費問題更為突出。厚樸是中國三木藥材（厚樸、杜仲和黃柏）之一，具有抗菌、抗炎鎮痛、抗腫瘤、中風和哮喘等主要臨床藥理作用；其主要成分為木脂素類物質、包括厚樸酚（Magnolol）、和厚樸酚（Honokiol），異厚樸酚、三羥基厚樸酚、去氫三羥基厚樸酚，其中和厚樸酚、厚樸酚是厚樸藥材中含量最高的有效成分，是評價厚樸藥材質量的標準檢測物。藥理試驗證明兩者具有松弛骨骼肌、殺蟲、殺菌、中樞抑制和抗潰瘍等作用。從厚樸渣中再提取木脂素類化合物極具應用前景和意義，不僅能減少環境污染，而且能帶來一定的社會經濟效益，目前已成為生物質資源與環境行業研究的熱點。

傳統中藥成分提取工藝以煎煮為主，此過程能夠溶解部分水溶性功效成分，厚樸渣中仍殘留較多有效成分。作為典型的厚樸功效成分，厚樸木脂素類化合物的提取與利用一直備受關注。已有提取方法主要為醇提、水提、堿溶酸沉法等，這些方法操作簡單、無需復雜設備，是目前工業中主要使用的方法。然而這些方法也存在許多問題，如溶劑使用量大、提取時間長、提取溫度高等。因此，尋找一種高效、綠色、易制備提取溶劑對中藥渣中殘留功效成分的提取具有重要意義。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）是由兩個或多個組分形成氫鍵作用形成的共晶混合物，因其在常溫下呈液體狀態，且具有與傳統溶劑相近的功能，引起廣泛關注。DES的組分包含氫鍵供體（Hydrogen Bond Donor，HBD）與氫鍵受體（Hydrogen Bond Acceptor，HBA），可被生物降解，符合綠色化學的要求，同時，DES制備過程簡單、可設計性強，有望成為傳統溶劑的綠色替代品。DES較常規溶劑滲透能力強，通過輔助分解植物細胞壁木質素、半纖維素及纖維素，使活性成分的溶出率增加。熊穎等發現采用氯化膽堿/草酸可有效提取多酚類化合物，提取率為常規甲醇溶劑的2倍以上；Cui等應用微波加熱方法輔助低共熔溶劑提取黃酮類化合物，黃酮提取率較傳統水熱浸提提高100%以上；Chanioti等發現檸檬酸/氯化膽堿所提取的總酚含量和抗氧化活性均高于均質化、微波、超聲波和高靜水壓力輔助等方法。此外，DESs可回收再利用，如利用醋酸鈉和乳酸合成的NADESs提取玉竹中的黃酮提取量為20.13 mg/g，回收利用一次提取量仍有18.79 mg/g；Zhang等重復利用氯化膽堿/草酸提取茯苓多糖，重復6次后其提取率為38.40%，較傳統的熱水提取提高了7.2倍。DES組成成分對中藥功效成分的提取效率影響較大，中藥功效成分的結構差異也顯著影響提取率。因此，了解提取過程中溶劑與溶質間相互作用機理，將對改善提取反應效率具有重要的指導作用。

本試驗以厚樸渣為提取研究對象，考察多種DES對厚樸渣中殘留木脂素類化合物的提取效率，篩選得到最優溶劑，考察主要影響因素對和厚樸酚、厚樸酚的提取率變化，優化提取工藝，旨在提高木脂素類化合物提取效果，為有效利用厚樸渣及拓展 DES應用領域提供理論支撐。最后，利用密度泛函理論對提取過程進行模擬與量子化學分析，研究低共熔溶劑與木脂素類化合物的相互作用，揭示復合體系組分之間相互作用關系，以期為設計高效提取溶劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

厚樸原料購買于神龍百草行經方藥材店（產地：四川），粉碎過篩，取300 g 20～40目（425～850m）顆粒大小厚樸粉用1.5～2.0 L去離子水煮沸半小時后于烘箱烘干至恒質量，得到干物質厚樸渣為后續試驗原料。和厚樸酚、厚樸酚標準品購于上海源葉生物科技有限公司，其他試劑購自上海麥克林生化科技有限公司，均為分析純。

1.2 DES的制備

DES組成參照表1，以氯化膽堿（Choline Chloride，ChCl）等為HBA，以一元酸、二元酸、二元醇等為HBD，按相應摩爾比制備10種DES。制備方法參照Abbott等方法，將 HBA與HBD混勻于厚壁耐壓瓶中，攪拌加熱至80～90 ℃約30～60 min，形成透明澄清的液體，密封保存備用。

1.3 不同DES對功效成分的提取效率比較

考察10種DES對厚樸渣中厚樸酚、和厚樸酚的提取效率，參照文獻報道，選取固液比1∶15 g/mL，將2 g厚樸渣與30 mL DES混勻于微波提取器，放入常壓微波反應器（MCR-3常壓微波反應器，廣州市星爍儀器有限責任公司）中進行提取反應，反應條件設置功率160 W、溫度50 ℃、反應時間30 min。反應結束后，反應物進行抽濾，殘渣用水沖洗干凈后烘干至恒質量，清液用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測提取物中各木脂素類化合物的含量。

表1 本試驗中所用低共熔溶劑Table 1 Deep Eutectic Solvents (DES) used in present study

1.4 不同反應因素對提取率影響的試驗設計

選取1.3中最佳提取溶劑，在不同反應時間（30、60、90、120 min）與反應溫度（30、50、70、90 ℃）條件下，分別對固液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25與1∶30 g/mL）、溶劑含水率（30%、40%、50%）、DES組成摩爾比（1∶2、1∶3、1∶4），進行單因素變量替換工藝流程中相應的常規量，考察各因素對木脂素類化合物提取效果的影響，以上每個處理均重復3次。同時，參考中國藥典中的厚樸提取方法，以甲醇作為溶劑代替低共熔溶劑，精密稱取0.2 g厚樸渣，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，浸漬24 h，考察其對厚樸渣中木脂素類化合物提取率。

1.5 分析方法

1.5.1 木脂素類化合物含量檢測方法

和厚樸酚、厚樸酚的含量檢測采用HPLC方法，液相色譜儀器型號為Alliance2695（Waters，USA），分離柱選用Waters XBridge BEH C18柱，柱溫30 ℃，進樣體積10L，流動相為甲醇∶超純水=78∶22（體積比），流速0.80 mL/min，示差檢測器2414的檢測波長：294 nm。以標準厚樸酚、和厚樸酚質量濃度（mg/mL）為縱坐標，時間（min）為橫坐標，繪制標準曲線，分別得出厚樸酚、和 厚 樸 酚 的 回 歸 方 程 為=1.51×10+3.42×10，=0.999 521，=1.66×10+3.32×10，=0.999 547，線性相關性良好。根據標準曲線計算出木脂素類化合物提取率（Extraction yield，mg/g）計算公式如下：

式中為提取溶液中木脂素類化合物的濃度，mg/mL；為提取溶液的體積，mL；為厚樸渣的質量，g。

1.5.2 DES提取木脂素類化合物的量子化學分析

DES的HBD和HBA初始猜測構型由gaussview軟件得到。以ChCl分別與有機酸類、醇類形成的DES的構象優化在M06-2X/6-311G**（**表示對該基組加一套d、p軌道的極化函數）的水平上進行，并通過虛頻檢驗保證獲得最穩定構型。利用密度泛函理論gaussian16 對DES進行單電能和頻率優化，得到能量最低的穩態結構，運用 Multiwfn和Vmd軟件計算分子表面靜電勢（Electrostatic Potential，ESP）和約化對比梯度密度（Reduced Density Gradient，RDG），分析DES的HBD和HBA分子間相互作用，分析DES的形成機理。RDG（無量綱的形式）分析采用約化密度梯度函數。

2 結果與分析

2.1 DES體系的選擇

DES配位劑組成會顯著影響植物活性物質的溶出，配置合成不同組分的混合物，其理化性質有較大的差異，考察了10種不同酸類、酮類物質為HBD的DES對厚樸渣木脂素類化合物提取能力。分析結果（圖1）顯示，氯化膽堿/乙酰丙酸（ChCl-La，DES-8）DES對厚樸渣中木脂素類化合物總提取率最高為20.31 mg/g，推測與ChCl-La破壞細胞膜結構的能力有關。

圖1 不同DES的總木脂素類化合物的提取效果Fig.1 Extraction yield of total lignanoids by different DES

氯化膽堿/乙酸（ChCl-AC，DES-9）、氯化膽堿/乳酸（ChCl-Lac，DES-6）對木脂素類物質的提取效果僅次于ChCl-La溶劑，總提取率分別為19.69、14.95 mg/g，其余以氯化膽堿為HBA的DES對木脂素類化合物提取效果較低。其中ChCl-Ur （DES-1）、MTAC-EG（DES-2）與ChCl-MEA（DES-3）提取液中未檢測到厚樸酚成分，ChCl-PA（DES-10）提取液中未檢測到和厚樸酚成分，故分別只計算對應提取到物質的提取率。根據試驗結果，選擇ChCl-La作為后續的研究對象。

2.2 固液比對木脂素提取率的影響

選取ChCl-La用于后續試驗中的厚樸渣中木脂素類化合物提取，分析固液比在不同反應溫度（30～90 ℃）、反應時間（0.5～2 h）對木脂素類化合物提取效果的影響。結果顯示（圖2），兩種目標化合物的提取率先增大后減小，當固液比為1∶25 g/mL時，總提取率平均值達到最高（32.87 mg/g），和厚樸酚、厚樸酚的提取率分別為9.93、22.95 mg/g。隨著溶劑用量的增加，目標化合物與溶劑充分接觸，萃取效果較好，當溶劑過多時會造成浪費，增加試驗成本，甚至不利于目標化合物的萃取。從圖中可以看出，固液比為1∶10 g/mL，溫度在50～90 ℃范圍內變化時，厚樸酚、和厚樸酚的提取率增幅較小，當固液比增加至1∶15 g/mL，時間在1～2 h之間時，隨著溫度的升高，厚樸酚、和厚樸酚的提取率在逐漸增加；而當固液比增加到1∶25 g/mL時，厚樸酚、和厚樸酚的提取率有了大幅提升，再次增加固液比至1∶30 g/mL時，目標化合物的提取率整體開始迅速下降，可能是因為溶劑的大量增加，造成目標提取物的濃度降低，使提取效率降低。因此，在下一步試驗中選擇1∶25 g/mL固液比進一步研究。

2.3 溶劑含水率對木脂素提取率的影響

試驗研究了相同的微波輔助提取條件下，溶劑含水率為30%、40%、50%對厚樸渣中兩種木脂素類化合物的提取率的影響（圖3）。總體而言，隨著含水率的增加，厚樸酚、和厚樸酚的提取率逐漸下降。當含水率為30%時，總提取率最高（32.87 mg/g），并且隨著溫度的升高和時間的延長，兩者的提取率均呈現逐步增加的趨勢。當含水率增至40%和50%，厚樸酚、和厚樸酚的提取率迅速下降，總提取率25.22 mg/g下降到14.44 mg/g。原因可能是高含水率會增加萃取介質的極性，破壞了ChCl-La溶劑與厚樸酚、和厚樸酚之間的氫鍵結合，從而對厚樸酚、和厚樸酚的提取產生了不利影響。并且在含水率為40%和50%時，在相同時間下，提高溫度對厚樸酚的提取率有顯著促進作用，而對和厚樸酚的提取率影響較小。

2.4 DES組成摩爾比對木脂素提取率的影響

綜合分析固液比與含水率的影響可知，提取條件為90 ℃、1.5 h時，黃酮的總提取率比較高，因此，選擇此條件作為固液比優化的反應條件。在提取條件為微波功率160 W、含水率30%基礎上，分析摩爾比為1∶2、1∶3、1∶4對木脂素類化合物提取率的影響。結果表明，隨著摩爾比的增加，厚樸酚、和厚樸酚的提取率呈現先降低后略微增加的趨勢（圖4），可能是因為DES體系中氫鍵受體比例的降低，造成目標化合物與溶劑之間氫鍵的形成受到限制，此外，乙酰丙酸比例的增加，使溶劑整體的極性增加，而厚樸酚、和厚樸酚兩種化合物的極性較低，導致二者提取率反而下降。

綜上所述，當氯化膽堿/乙酰丙酸摩爾比1∶2、含水率30%、固液比1∶25 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時間1.5 h時，和厚樸酚、厚樸酚的提取率最高，分別為9.93、22.95 mg/g，總提取率為32.87 mg/g。采用中國藥典甲醇法提取厚樸渣，在相同條件下得到總木脂素提取率為6.64 mg/g，使用DES的總提取率相比中國藥典甲醇法提高了395.03%。

圖2 不同固液比的ChCl-La對木脂素類化合物的提取率Fig.2 Lignanoids extraction rates by ChCl-La with different solid-liquid ratios

圖3 不同含水率的ChCl-La在對木脂素類化合物的提取率Figure 3 Extraction rate of lignanoids by the solvents with different water contents

圖4 不同組成摩爾比的ChCl-La對木脂素類化合物的提取率Fig.4 Lignanoids extraction rates by ChCl-La with different molar ratios

2.5 DES形成及萃取木脂素類化合物的機理分析

基于密度泛函理論的自洽場分子軌道法在M06-2X/6-311G**基組水平上對和厚樸酚、厚樸酚和本文選用的DES（ChCl-La）以及相應低共熔溶劑-木脂素類化合物體系進行幾何構型優化，得到其最穩定構型。為了直觀刻畫木脂素類化合物與低共熔溶劑分子結構之間的相互作用，本文對優化的復合體系進行Kohn-Shame波函數計算，并基于約化密度梯度（RDG）方法對復合體系的分子間相互作用進行可視化分析。

和厚樸酚、厚樸酚與ChCl-La的 RDG 等值面和填色分析結果如圖5所示。由圖5可知，和厚樸酚、厚樸酚的喹啉環中存在明顯的紅色棱形區域，說明六元環中較強的位阻效應，與散點圖中對應（+0.01，+0.05）之間的紅色部分相吻合。綠色和墨綠色片狀明顯分布在和厚樸酚、厚樸酚與ChCl-La中間區域，以及ChCl-La之間，對應散點圖中（-0.02，0.01）部分，證實了ChCl-La的Cl原子與厚樸酚、厚樸酚之間的弱相互作用主要表現為氫鍵作用力。此外，厚樸酚的兩個氧甲基之間也存在少量藍色片狀分布，對應散點圖中的（-0.05，-0.02）之間的藍色部分，是厚樸酚分子內氫鍵相互作用的體現。因此，RDG 等值面和散點分析形象直觀地說明和厚樸酚、厚樸酚與ChCl-La之間的作用力主要是弱相互作用，表現為范德華力和氫鍵作用。

物質的互溶度是由溶質和溶劑的分子間相互作用力來決定的，溶劑對溶質的溶解在于溶質－溶劑間的相互作用能夠抵消溶質－溶質、溶劑－溶劑間的相互作用，即溶解過程自由能變小于0。為了考察DES對木脂素類化合物的萃取能力，利用高斯軟件計算ChCl-La與厚樸酚、和厚樸酚的結合能。計算結果表明，ChCl-La與厚樸酚的分子間相互作用結合能為-81.386 kJ/mol，即ChCl-La和厚樸酚的相互作用為放熱過程，二者的結合在能量上是有利的；ChCl-La與和厚樸酚的分子間相互作用結合能為280.297 kJ/mol，即ChCl-La和厚樸酚的相互作用為吸熱過程，二者的結合在能量上是不利的。由此可見，ChCl-La與厚樸酚分子之間結合更加緊密，故ChCl-La對厚樸酚萃取能力大于和厚樸酚。

圖5 ChCl-La-木脂素類化合物相互作用的填色圖Fig.5 Color-filled maps of intermolecular interactions between ChCl-La and lignanoids

3 結 論

1）合成了10種綠色、環保、成本低的低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DES）用于提取厚樸渣中和厚樸酚、厚樸酚兩種木脂素類化合物，其中，氯化膽堿/乙酰丙酸（ChCl-La）提取效率最高。考察了ChCl-La的DES組成摩爾比、含水率、固液比、提取溫度和時間等因素對兩種木脂素類化合物提取率的影響，提取工藝參數：摩爾比1∶2、固液比為1∶25 g/mL、溶劑含水率為30%、提取溫度90 ℃、提取時間1.5 h，和厚樸酚、厚樸酚的提取率最高分別為 9.93、22.95 mg/g，總提取率為32.87 mg/g。

2）對ChCl-La與木脂素類化合物的量子化學分析表明，DES形成過程相互作用力以氫鍵作用為主，以范德華力為輔，無共價鍵、離子鍵等化學鍵形成。DES對厚樸酚提取過程，氫鍵作用發揮主要作用；DES提取和厚樸酚過程，以范德華力等弱作用力為主，無氫鍵形成。綜上可見，低共熔溶劑與提取物之間氫鍵強度顯著影響提取效果的差異，通過現代密度泛函理論的分子模擬計算低共熔溶劑與提取功效成分的相互作用，可指導快速篩選優良溶劑。