同位素標記相對與絕對定量技術篩選出Vinculin蛋白在進展期胃癌組織中低表達及其預后意義

盧 珊 張 磊 蘇 瑩 侯陳建 王美麗 劉秀萍，△

（1復旦大學基礎醫學院病理學系 上海 200030；2復旦大學附屬中山醫院病理科 上海 200032；3復旦大學附屬上海市第五人民醫院病理科 上海 201100）

胃癌（gastric carcinoma，GC）是消化系統惡性腫瘤［1］。盡管治療方面有進展，并且其發病率有所下降［2］，但在中國惡性腫瘤總體發病率和死亡率排行中，它均居于第二位［3］，5年生存率約為20%。胃癌的高死亡率除了與發病癥狀隱匿有關外，主要歸因于晚期病例的高復發率和遠處轉移［4］。有研究顯示，癌組織的浸潤與轉移是胃癌復發的重要臨床指征，胃癌浸潤與轉移情況及患者預后緊密相關［5-6］。因此，胃癌進展的潛在機制研究十分重要。

黏著斑蛋白Vinculin是細胞黏附的主要調節劑［7］，可將含肌動蛋白的微絲錨定在質膜上，并使細胞附著在基質上。自從Vinculin被鑒定以來，已經取得很多研究進展，其功能被逐漸了解。Vinculin結構保守，可參與多種化學信號轉導過程。對其在細胞黏附、收縮變形、細胞遷移中的作用的研究發現，Vinculin對于傳遞機械力和協調機械信號事件非常重要。腫瘤轉移需要細胞侵襲結締組織，這實質上是一種機械作用，涉及黏附、形狀改變、運動和力產生。而解除對Vinculin的調控，則會導致細胞黏附、收縮、運動和生長的改變［8］，提示Vinculin可能影響著腫瘤的發生、轉移和侵襲。

有報道認為，Vinculin在肺癌組織中的蛋白水平顯著少于癌旁，且Vinculin表達與TNM分期以及淋巴結轉移緊密相關［9］。在不同腫瘤中，Vinculin的蛋白水平并不一致。有報道發現Vinculin在前列腺癌、胰腺癌、腎癌等腫瘤中表達升高［10-12］，而在鱗狀細胞癌、神經內分泌瘤、結直腸癌等腫瘤中表達降低［13-14］。這些不一致的研究結果可能與實驗所用的不同細胞有關，也可能因為Vinculin在不同類型的癌中有不同的表達特點。Vinculin是癌癥的增強還是抑制因子目前尚無定論。

Vinculin在胃癌侵襲和轉移中的生物學作用的研究較少。因此，我們擬檢測Vinculin蛋白在臨床樣本中的表達情況。前期收集了110位患者的胃癌標本，結合隨訪信息等臨床資料，使用免疫組織化學技術進行了檢測，并統計分析Vinculin在標本中的表達量及其與主要臨床指征（包括但不限于：腫瘤大小、分期、淋巴結轉移、預后等）的相關性，通過對Vinculin蛋白水平的監測，為胃癌臨床診療提供幫助。

材料和方法

病理資料應用同位素標記相對與絕對定量蛋白組學（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術檢測的組織樣本6例，為2009年5月—2010年6月在復旦大學附屬腫瘤醫院行手術切除全胃5例和近端胃1例標本。手術標本離體半小時內，在不影響后續診療的前提下切取小塊腫瘤組織或距離腫瘤組織邊緣10 cm以上的正常黏膜組織，立即低溫冷凍保存；經病理證實，均為低分化腺癌（T 4N2～3M 0，Ⅲc），術后均行常規方案輔助化療，依據2年內是否發生復發或遠處轉移，將病例分為復發組（無疾病進展時間3～14個月）3例與未復發組3例，以復發組遠離瘤巢區正常黏膜組織為正常對照組。收集1990年2月—1998年7月110例胃腺癌根治術患者的臨床病理資料?；颊咝g前均未接受放、化療。入院患者均簽署了標本研究的知情同意書。所有病例均經兩名資深病理醫師再次復片確診胃腺癌。收集的臨床病理資料包括：患者年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤大小、分化情況、脈管及神經束侵犯和淋巴結轉移等。pTNM分期依據第8版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）p TNM分期標準。

新鮮組織標本iTRAQ蛋白質譜檢測根據既往文獻報道和操作規范［15］。（1）提取并標記組織蛋白，丙酮沉淀樣品蛋白，還原劑還原樣品蛋白，半胱氨酸封閉樣品蛋白，用trypsin酶解蛋白樣品；iTRAQ試劑分別標記樣品酶解物——118標記復發組、119標記未復發組和121標記正常黏膜組，充分混合混勻。（2）第一維強陽離子交換（strong cation exchange，SCX）層析法分餾樣品，添加緩沖液A，震蕩混勻；以20 AD HPLC系統的SCX層析法分餾蛋白多肽，樣品混合液添加到聚亞硫乙基柱（2.1 mm×100 mm，5μm，200?），通過含有梯度為0、5%、10%、20%、40%、80%緩沖液B的緩沖液A，以200μL/min的流速分離蛋白多肽60 min，檢測樣品在214 nm和280 nm的吸光度值（D），共搜集得到25個SCX餾分。緩沖液A：10 mmol/L KH2PO4，25%乙腈，pH=2.6；緩沖液B：10 mmol/L KH2PO4，5%乙腈，1 mol/L KCl，p H=2.6；Diluent：25%acetonitrile，p H=2.6。（3）第二維反相液質聯用RPLC-MS/MS，上一級搜集到的餾分溶液，4℃下20 000×g真空離心風干30 min，復溶于50μL HPLC緩沖液A，上樣入ZORBAX 300SB-C18反 相 柱（5μm，300?，0.1 mm×150 mm），以0.3μL/min的流速通過5%～80%梯度的HPLC緩沖液B（95%ACN，0.1%蟻酸）90 min，通過聯合20AD HPLC系統的QSTAR XL方法分析流通數據，由一級質譜（m/z：400～1 800）聯合二級質譜（m/z：100～2 000），獲得掃描數據。其中根據一級質譜（MS）的圖像，選擇4個峰值最高的片段，即前驅離子（precursors），進行二級掃描，獲得串聯二級質譜（MS/MS）的信息。每個SCX餾分進行串聯分析/重復鑒定2次。MS數據通 過 ProteinPilot軟 件（v 4.2）在International Protein Index（IPI）數據庫（v 3.45）中檢索并鑒定多肽。（4）質譜校正并設定相應的參數。（5）由Paragon Algorithm檢索多肽信息，確定候選蛋白，并經由軟件自帶的Pro Group Algorithm運算法則作進一步的驗證。（6）差異蛋白的篩選：在前述候選蛋白的基礎上，符合以下標準的蛋白質被認為有組間差異變化，用于進一步的分析研究，即①Unused ProtSore＞1.3，至少1條肽鏈具有95%CI；②蛋白相對表達量閾值設為≥1.25或≤0.8；③P＜0.05。

石蠟包埋組織免疫組織化學染色采用免疫組化增強標記聚合物系統（Enhance Labelled Polymer System，ELPS）法檢測110例胃癌標本中Vinculin的表達。具體操作步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行，組織切片常規脫蠟、水化，PBS緩沖液沖洗，一、二抗孵育，DAB顯色，蘇木精襯染及乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。一抗Vinculin抗體購自德國Sigma公司，鼠抗，1∶200；HRP偶聯二抗、DAB均購自丹麥Dako公司。Vinculin表達定位在細胞胞質，陽性對照為平滑肌組織，陰性對照為淋巴細胞。分別評估染色的強度（staining intensity，SI）和陽性細胞百分率（positive proportion，PP），SI由無著色、淺黃色、棕黃色、黃褐色分別記為0～3分，PP由5%、25%、50%、75%截斷值分別記為0～4分，免疫反應積分（immunoreactive score，IRS）=SI×PP，得分≥3分者判為陽性；得分＜3分者判為陰性。

隨訪患者均通過電話或者復查隨訪。無病生存期（disease free survival，DFS）指從患者手術之日起到出現復發、轉移、死于食管癌的時間或死亡患者記錄最后一次隨訪的時間?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為手術后到患者死亡的時間或最后1次隨訪的時間。隨訪截至2000年1月。

統計學分析使用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析，以Spearman’s correlation和Pearson Chi-Square檢驗來檢測Vinculin蛋白表達水平與主要臨床病理指征之間的關聯。由Kaplan-Meier生存曲線分析Vinculin蛋白表達水平與總體生存期的聯系。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

iTRAQ技術臨床標本蛋白質譜檢測結果iTRAQ技術聯合二維液相色譜串聯質譜（2D LCMS/MS），符合數據質量控制要求，按照95%的置信區間下Protein-Threshold＞1.3的標準，鑒別出3 566條多肽，歸納識別出570種蛋白質。結合iTRAQ技術中ParagonTM Algorithm運算法則的結果和文獻參考，篩選具有組間差異性表達的蛋白，胃癌復發組相對于正常胃黏膜組差異表達的蛋白有13種，其中2種（Keratin/type I cytoskeletal 19、Matrin-3）表達上升、11種（Neuroblast differentiationassociated protein AHNAK、Filamin-A、Hemoglobin subunit、Vinculin、ATP synthase subunit alpha，mitochondrial等）表達下降；胃癌未復發組相對于正常胃黏膜組差異表達的蛋白有8種，其中5種表達上升、3種表達下降，但多數差異無統計學意義。其中，相對正常黏膜組，Vinculin蛋白在胃癌復發組表達水平降低（118：121倍值為0.787，P=0.004），而在胃癌非復發組的表達差異無統計學意義（P=0.058）。

胃癌臨床標本中Vinculin蛋白質的表達情況在110例人胃癌組織標本中，Vinculin陽性46例（41.8%）、陰性64例（58.2%）（圖1）。

圖1 胃癌組織中Vinculin表達的代表性IHC染色結果（200×）Fig 1 Representative IHC staining of Vinculin expression in GC tissue（200×）

胃癌石蠟組織標本中Vinculin蛋白質的表達與總生存率的相關性具有完整隨訪資料86例，隨訪1～92個 月，患 者1、3、5年 總 體 生 存 率 分 別 為88.4%、77.9%和69.7%；Vinculin陽性和陰性患者的中位總生存期（overall survival，OS）分別為36個月和28個月。Kaplan-Meier生存分析顯示，Vinculin陰性患者的總生存率低于Vinculin陽性患者（P=0.011，圖2）。

圖2 Vinculin陽性與陰性患者總體生存率分析Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis of GC grouped by positiveor negative expression of Vinculin

胃癌臨床標本中Vinculin蛋白質的表達與臨床病理特征的關系統計結果顯示，Vinculin的低表達與淋巴結轉移（P=0.018）、腫瘤TNM分期（P=0.022）、血管侵襲（P=0.002）具有顯著的相關性（表1、表2）。

表1 110例人胃癌組織標本的臨床病理特征Tab 1 Clinicopathological characteristicsof 110 human gastric cancer tissue specimens

表2 Vinculin蛋白質的表達與臨床病理特征的關系Tab 2 The relationship between Vinculin expression and clinicopathological features ［n（%）］

討 論

Vinculin是在黏著斑中發現的一種分布于胞質的蛋白，參與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）與肌動蛋白細胞骨架的連接過程。近些年，Vinculin的下調陸續在幾個高度轉移性癌細胞中被發現［13，16-18］。但是目前尚未發現對Vinculin在胃癌中表達的報道，Vinculin對胃癌侵襲和轉移的作用以及對胃癌復發的影響尚不明確。

本課題運用iTRAQ技術在臨床胃癌復發組、未復發組和正常胃黏膜組進行蛋白質質譜掃描。在鑒別出的570種蛋白中，挑選出有組間差異表達的蛋白質，與正常胃黏膜組相比，黏著斑蛋白Vinculin在胃癌復發組表達顯著下調，而在胃癌未復發組表達差異不顯著。提示Vinculin蛋白可能在胃癌的復發中具有一定的功能和影響，但其在胃癌侵襲和轉移中的生物學作用還有待進一步探索。

為進一步分析篩選出的差異表達蛋白質的功能聚類，我們對差異蛋白作GO（Gene Ontology）分析。運用Gene Ontology-AmiGO 2提供的在線分析工具PANTHER Classification System，對差異蛋白做功能聚類分析：發現蛋白分子功能集中在結合肌動蛋白、酶催化活性調節、細胞結構分子活性等；

主要參與到細胞黏附、細胞骨架結構重排、代謝過程等生物學進程。

接著對這些蛋白作KEGG（京都基因與基因組百科全書）Pathway分析。KEGG是基因組破譯方面的數據庫，使用計算機技術利用基因信息對更高層次和更復雜細胞活動和生物體行為作出計算推測。可能由于篩選出的蛋白量較少，未能得到Pathway的聚簇。

在110例石蠟包埋的胃癌臨床標本組織中，我們采用免疫組織化學技術，檢測了Vinculin的蛋白表達水平，并根據免疫組化結果，分析了Vinculin與臨床病理參數以及患者生存率的關系。根據免疫組織化學染色評分結果，我們發現，Vinculin的缺失表達與胃癌淋巴結轉移、腫瘤TNM分期、血管侵襲均具有顯著的相關性，提示胃癌惡性程度越高，Vinculin表達越低。生存曲線分析結果提示，Vinculin缺失表達與胃癌患者較短的生存期有關聯，提示Vinculin蛋白是胃癌患者生存預后具有意義的分子指標。

細胞-細胞黏附的喪失對于癌癥侵襲和轉移的發展是重要的［18］，既往研究［19］顯示，黏著斑蛋白缺損與細胞黏附減少和細胞運動增加有關，表明其可能在轉移性生長中起作用。Yang等［20］在結直腸癌中發現黏著斑蛋白表達下降與腫瘤發生和轉移風險增加之間存在關聯。本研究結果顯示，Vinculin缺失表達與胃癌的侵襲和轉移正相關，Vinculin表達減少，將會使胃癌細胞黏附減少，運動性增加，導致癌細胞的分離和向基底膜的侵襲。

我們通過iTRAQ蛋白質譜分析，發現Vinculin在胃癌復發相關因素中具有差異性表達；在臨床標本驗證中發現Vinculin的缺失表達與胃癌的侵襲轉移顯著正相關，通過臨床胃癌組織標本的檢測，我們初步確認了Vinculin蛋白的缺失表達與胃癌腫瘤的發生發展具有顯著相關性，并提示患者預后不良。但目前研究樣本量較少，也受到諸如臨床標本選擇、樣本類型和數量等因素的影響，其內在機制尚待進一步探究。在以后的研究中，可增加樣本量，并深入探究Vinculin表達水平對胃癌細胞的生物學行為（增殖能力、克隆形成能力、體外侵襲轉移能力等）的影響及其發揮生物學作用的相關分子機制。

我們的研究表明，Vinculin的低表達與胃癌的淋巴結轉移、腫瘤TNM分期、血管侵襲顯著正相關。Vinculin表達情況或可作為胃癌患者生存的預測因子。

作者貢獻聲明盧珊 文獻調研與整理，論文撰寫和修改。張磊 論文構思與修改，數據采集，實驗實施。蘇瑩，侯陳建，王美麗 論文修訂。劉秀萍 監督指導。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。