輕重癥及轉歸階段的COVID-19患者免疫細胞的單細胞轉錄譜分析

王 正 張倩月 宋懷東

（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院分子診斷與內分泌科 上海 200011）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2（SARS-CoV-2）感染所引起的一系列疾病，患者表現從無明顯癥狀到全身器官衰竭，甚至死亡［1］。盡管和SARS-CoV一樣，SARS-CoV-2進入靶細胞的受體為血管緊張素轉換酶2（angiotensin I converting enzyme 2，ACE2）［2-3］，但這兩種病毒的增殖模式卻有所不同。SARS-CoV-2在癥狀發生前，即可在呼吸道中被檢測到［4-6］，而且在癥狀發作后，病毒負荷很快達到峰值［7-9］。這些特點導致SARS-CoV-2的傳染性極高，由此引發了全球的COVID-19大流行。SARS-CoV-2感染和機體的免疫反應均可以直接或間接破壞患者的呼吸道細胞［2，10］，大多數患者表現為輕度至中度的癥狀，進展為重度肺炎的概率高達15%，并有約5%的患者最終發展為急性呼吸窘迫綜合征伴有或不伴有多器官衰竭［2］。老年和免疫功能低下的COVID-19患者病死率較高［11-14］。

由于目前尚無針對SARS-CoV-2的有效藥物，因此迫切需要了解疾病期間宿主的免疫反應，以便篩選預后和診斷的指標，為重癥患者制定適當的治療措施提供指導。

急性病毒感染和宿主的免疫反應在體內相互作用，是影響疾病嚴重程度以及患者臨床預后的主要因素［10］，因此COVID-19的免疫病理學受到了廣泛關注。目前，針對非重癥COVID-19患者的免疫反應的研究顯示，急性SARS-CoV-2感染可引起強烈的細胞免疫和體液免疫反應，但是尚不清楚先天性和適應性免疫反應是如何導致肺部損傷的［15］；而重癥患者則表現出明顯的淋巴細胞減少和血清促炎因子升高［16-17］。有報道稱，在一個死亡病例的雙肺中存在明顯的間質淋巴細胞浸潤，并在該病例外周血中發現T細胞過度活化［18］。此外，在重癥COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗液中發現炎癥性FCN1+巨噬細胞取代了FABP4+巨噬細胞，而在非重癥SARS-CoV-2感染患者支氣管肺泡灌洗液中觀察到大量擴增的組織駐留性CD8+T細胞［19］。這些發現部分揭示了COVID-19發生發展的免疫病理學機制，但對于不同病情下的抗病毒或致病性免疫反應的理解仍不夠充分。

在這項研究中，我們通過整合重癥、輕癥、恢復早期以及恢復晚期的COVID-19患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的單細胞轉錄組（single-cell RNA sequence，scRNAseq）數據［20-21］并進行分析，進而構建出輕重癥及轉歸階段的COVID-19患者外周血免疫細胞的高分辨率轉錄組圖譜，從而研究SARS-CoV-2感染不同時期的轉錄變化，以便更好地了解該疾病進展和恢復過程中人體的免疫反應改變。

材料和方法

數據集從ENA（European Nucleotide Archive）數據庫中獲得已公開的來自COVID-19重癥患者、輕癥患者和健康對照PBMCs的單細胞RNA-seq數據（https：//www.ebi.ac.uk/ena/browser），登錄號為SRP259912［20］；已公開的恢復期患者數據來自GSA（Genome Sequence Archive）數據 庫（https：//bigd.big.ac.cn/gsa/browse），登 錄 號 為CRA 002497［21］。數據格式均為fastq。COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測均為陽性。其中，正在使用機械通氣或體外膜氧合等呼吸支持療法的COVID-19患者為重癥患者，不需要呼吸支持療法者為輕度患者。SARSCoV-2核酸檢測轉陰者為恢復期患者，早期恢復患者核酸檢測轉陰天數＜7天，晚期恢復患者核酸檢測轉陰＞14天。

scRNA-seq數據處理通過CellRanger v.4.0.0（https：//support.10xgenomics.com/）軟 件，使 用GRCh38版本的人類參考基因組，為每個樣本生成初始基因表達矩陣。通過R軟件v.3.6.4（http：//satijalab.org/seurat/）和Seurat包v.3.1.0［22］分析初始的基因表達矩陣。首先，選擇表達基因的細胞數目（min.cells）＞10的基因，并選擇表達基因數（min.features）＞200的細胞進行進一步分析。如果細胞符合以下條件，則將其刪除：（1）表達基因數＞4 500個；（2）表達基因數＜200個；（3）來自線粒體基因組的UMI＞15%。去除低質量細胞后，使用Seurat軟件包標準流程對數據進行非線性降維和聚類。

樣本數據整合為了比較不同條件下的細胞類型和比例，我們采用Seurat［23］教程中所述的整合方法通過Seurat軟件包（v.3.1.0）將來自不同樣本的scRNA-seq數據集整合成一個數據集，從而將來自不同樣本的細胞進行整合分析。

細胞的再聚類從PBMCs中提取B細胞、T細胞、NK細胞和先天免疫細胞（除外NK細胞）。分別對這幾種主要的細胞類型再次進行歸一化、主成分分析和聚類，以便生成更加精細的亞群。

細胞類型注釋在通過UMAP進行非線性降維并將所有細胞投影到二維空間后，細胞會因為表達譜相近而在二維空間中聚集在一起。Seurat中的Find AllMarkers函數用于查找每個已識別聚類的特異表達基因。然后將特異表達基因對照特征性細胞標志物對聚類進行分類和注釋。表達兩個或多個特征性細胞標志物的聚類被分類為雙峰細胞，并從進一步的分析中排除。

差異表達基因識別和富集分析使用Seurat中的Find Markers函數進行差異表達基因（differential expression genes，DEG）分析，并且使用Benjamini-Hochberg方法估計錯誤發現率（false discovery rate，FDR）。使用log2（fold change）＞1和FDR＜0.01過濾DEG。使用Metascape網絡工具（www.metascape.org）對DEG的功能進行富集分析。富集基因集為GO Biological Process Ontology。

其他統計分析使用Kruskal-Wallis檢驗細胞亞群的比例在不同分組之間的差異。使用經Bonferroni法校正的Dunn’s檢驗進行細胞亞群比例兩兩配對檢驗。

結 果

PBMCs的單細胞轉錄譜為了分析COVID-19患者外周血的免疫學特征，我們對20名患者和5名健康對照（HC）的PBMCs的單細胞轉錄組數據進行分析。根據數據庫所提供的臨床表現，將20例COVID-19患者分為4類：重度（severe；n=5；使用呼吸支持治療）、輕度（mild，n=5，未使用呼吸支持治療）、恢復早期（ERS，n=5，核酸轉陰＜7天）、恢復晚期（LRS，n=5，核酸轉陰＞14天）。經過質控后，共計115 334個高質量細胞及6.5億個獨特的轉錄本納入下游分析。在這些細胞中，10 744個細胞（9.3%）來自重度患者，19 210個細胞（16.7%）來自輕度患者，31 647個細胞（27.4%）來自恢復早期患者，27 994個細胞（24.2%）來自恢復晚期患者，25 739個細胞（22.3%）來自正常對照。將所有高質量細胞整合在一起，并校正測序深度和線粒體轉錄本比例后，對所有細胞的轉錄組數據進行主成分分析（圖1A）。我們使用UMAP方法根據已知細胞標志物分離出10種主要的細胞類型和22種細胞亞型（圖1A、1B）。主要的細胞類型包括CD14+單核細胞（CD14+mono，LYZ+CD14+）、CD16+單核細胞（CD16+mono，LYZ+FCGR3A+）、2型經典型樹突細胞（cDC2，CD1C+）、漿細胞樣樹突狀細胞（pDC，LILRA 4+）、自然殺傷細胞（NK，KLRF1+）、幼稚狀態T細胞（na?ve T，CD3E+CCR7+）、活化狀態T細胞（activated T，CD3E+PRF1+）、增殖性T細胞（proliferative T，CD3E+ MKI67+）、B細 胞（MS4A 1+）、漿細胞或漿母細胞（plasma/plasmablast，MZB1+）。

圖1 健康對照和COVID-19患者的PBMCs單細胞轉錄譜Fig 1 Single-cell transcriptional landscape of PBMCs in HC and COVID-19 patients

輕重癥及轉歸階段的COVID-19患者PBMCs的組成差異為了揭示重癥、輕癥、恢復早期和恢復晚期的COVID-19患者PBMCs的細胞組成差異并與健康對照進行比較（圖2A），我們根據scRNAseq數據計算了每個人PBMCs中10種主要細胞類型占其所有PBMCs的百分比（圖2B），發現p DC、cDC2、NK細胞、增殖性T細胞、B細胞、漿細胞的外周血占比在疾病的不同階段均有變化（圖2C）：其中，重癥患者PBMCs中pDC的比例明顯低于恢復早期患者和健康對照，而cDC2的比例明顯低于恢復晚期患者，提示這兩種DC可能對于疾病康復有獨特的作用。與健康對照相比，重癥患者PBMCs中NK細胞的比例明顯降低，且隨著病情的恢復，NK細胞的比例有上升的趨勢。與NK細胞變化趨勢相反，重癥患者外周血增殖性T細胞在PBMCs中占比明顯高于恢復早期和恢復晚期患者，且隨著病情的恢復，增殖性T細胞的比例呈下降趨勢，提示NK細胞和增殖性T細胞可以作為病情嚴重程度的指標衡量患者的臨床狀態。此外，恢復早期患者PBMCs中B細胞的比例在所有分組中最低，且顯著低于輕癥及重癥患者。而令人意外的是，恢復早期患者的PBMCs中漿細胞的比例和重癥患者相近，均明顯高于健康對照，也均明顯高于輕癥患者。以上結果表明，DC、NK細胞、增殖性T細胞、B細胞和漿細胞在不同狀態的COVID-19患者，尤其是重癥患者中變化較為明顯，其中參與先天免疫的DC和NK細胞顯著降低，而參與適應性免疫的增殖性T細胞、B細胞和漿細胞顯著增高，提示過高的獲得性免疫反應可能為重癥患者多器官功能破壞的潛在原因。

圖2 輕重癥及轉歸階段的COVID-19患者PBMCs的細胞組成差異Fig 2 Differences in cell composition of PBMCsin COVID-19 patients with mild and severeand prognosis states

COVID-19患者先天免疫細胞亞群的特征從單核細胞、NK細胞中提取亞群，并根據細胞標志物的表達和分布定義細胞亞群類型。共得到8個更加精細的先天性免疫細胞亞群（圖3A、B），分別是CD14+單核細胞（CD14+mono）、CD16+單核細胞（CD16+mono）、來源于CD14+單核細胞的炎癥性單核細胞（infla mono，CD14+AREG+CCL 5+）、漿細胞樣樹突狀細胞（p DC）、2型經典型樹突細胞（cDC2）、NK細 胞、XCL 1+NK細 胞（KLRF1+XCL 1+）和CCL 3+NK細胞（KLRF1+CCL 3+）。

分析先天免疫細胞中各亞群在PBMCs中的比例（圖3C），發現CD14+單核細胞、炎癥性單核細胞、pDC細胞、cDC2細胞、NK細胞和XCL 1+NK細胞在輕重癥及轉歸階段的COVID-19患者PBMCs中的占比發生了變化。其中，與健康對照相比，CD14+單核細胞的PBMCs占比只在重癥患者中有明顯升高，約為健康對照的2倍；而炎癥性單核細胞的比例在輕重癥患者，尤其是重癥患者PBMCs中，相比恢復期患者有顯著升高，是恢復早期患者的20倍以上，說明炎癥性單核細胞與COVID-19的嚴重程度密切相關，可能在介導多器官損害中發揮重要作用；在重癥患者PBMCs中幾乎不存在1型干擾素IFNα的主要分泌細胞p DC，明顯低于健康對照和早期恢復患者，而其在早期恢復患者中比例最高，提示p DC及其分泌的IFNα可能有助于機體的抗病毒免疫反應；除了CCL 3+NK細胞比例在輕癥患者中相比于健康對照無明顯變化外，不同NK細胞亞群和cDC2在重癥患者PBMCs中的占比相比于恢復患者和健康對照均呈下降趨勢，與前面的結果一致。

為了進一步研究SARS-CoV-2感染后先天免疫細胞的轉錄組變化，我們將重癥患者和輕癥患者合并為感染期患者組，并比較了感染期患者的單核細胞、NK細胞、DC細胞與健康對照相比在表達模式上的差異（圖3D～F）。我們發現，COVID-19感染期患者先天免疫細胞中上調的差異表達基因（DEG）可以富集到免疫反應調節、IL-12相關免疫反應、髓系細胞分化、白細胞活化、細胞因子產生等通路上。

圖3 先天性免疫細胞亞群比例及轉錄組特征分析Fig 3 Proportion and transcriptome characteristicsof congenital immunecell subsets

COVID-19患者T細胞亞群的特征為了分析在不同疾病條件下，COVID-19患者T細胞亞群的變化，我們按照表達譜，對T細胞進行分群，并根據T細胞標志物的表達和分布獲得了4個CD4+T細胞亞型（CD3E+CD4+），以及5個CD8+T細胞的亞型（CD3E+CD8A+）（圖4A、4B）。

在4個CD4+T細胞亞型中，我們定義出CD4+初 始T（na?ve T）細 胞（CD4+CCR7+SELL+）、CD4+細胞毒性T（cytotoxic T lymphocyte，CTL）細胞（CD4+GPR183-GZMA+）、CD4+中央記憶性T（central memory T cell，TCM）細 胞（CD4+GPR183+GZMA-）、調 節 性T（Treg）細 胞（FOXP3+IL 2RA+）。我們發現，CD4+CTL細胞既高表達GNLY，又高表達TBX21，表明它是1型輔助性T（TH1）細胞，并高表達細胞毒性相關基因，如NKG7、GZMA、GZMB；CD4+TCM細 胞 高 表 達GATA 3，具有2型輔助T（TH 2）細胞特征，且低表達上述細胞毒性相關基因。CD8+T細胞中包括1個CD8+初 始（CD8+na?ve）T細胞 亞 群（CD8+CCR7+SELL+）、1個CD8+細 胞 毒 性T（CD8+CTL）細胞亞群（CD8+GNLY+）、2個效應記憶性T（effector memory T）細胞亞群（CD8+GZMK+TEM和CD8+GZMK-TEM），兩者都具有高表達GZMA和NKG7，但CD8+GZMK+TEM特征性表達GZMK，而CD8+GZMK-TEM則高表達GZMB和TBX21。還有一個增殖性CD8+T/NK（proliferative CD8+T/NK）細胞亞群（CD8+STMN 1+），由于都高表達增殖性細胞標志物STMN1和MKI67，聚類非常接近。

在分析了不同疾病條件下各個T細胞亞群在總T細胞中的占比后，我們發現僅有GZMK+CD8+TEM細胞和增殖性CD8+T/NK細胞在疾病不同時期的占比發生了明顯變化（圖4C）。我們發現，在T細胞中增殖性CD8+T/NK細胞的比例在重癥患者中顯著高于其他組，且與恢復晚期患者和健康對照相比差異有統計學意義，提示重癥患者中CD8+T/NK細胞顯著增殖和激活，與在其他感染中觀察到的抗病毒反應一致。而GZMK+CD8+TEM細胞的T細胞占比僅在輕癥患者中明顯高于恢復期患者。CD8+na?ve T細胞占比在各組間的差異雖然沒達到統計學意義，但恢復組占比為其他組的2～3倍。

為了進一步研究SARS-CoV-2感染后T細胞轉錄組的變化，我們對成熟T細胞（CTL、TEM、TCM）進行了評估。與健康對照相比，疾病期和康復期患者的成熟T細胞中上調的DEG所富集到的通路既有相似的通路，又有不同的通路。與健康對照相比，在疾病期和康復期患者的成熟T細胞具有高表達基因的功能（圖4D、4E），與T細胞活化、淋巴細胞增殖、白細胞激活以及先天免疫反應調節的相關基因表達均有上調。但在疾病期患者的成熟T細胞中，與IL-12、IL-7和IFN-γ信號通路相關的基因表達上調；而在康復期患者中，與免疫系統負調控相關的基因表達有所上調。提示在疾病進展到康復期后，機體的免疫強度逐步下調。

圖4 T細胞各亞群占比和轉錄組特征分析Fig 4 Proportion and transcriptome characteristics of T cell subsets

COVID-19患者B細胞亞群的特征我們根據B細胞標志物的表達和分布將B細胞分為4個亞群，包括1個初始B（na?ve B）細胞亞群（MS4A 1+IGHD+CD27-）、1個記憶B細胞（memory B）亞群（MS4A 1+CD27+IGHD-）、1個 中 間 記 憶B（intermediate B）細胞亞群（IGHD+CD27+）和1個漿細胞和漿母細胞（plasma/plasmablast）亞群（MZB1+CD38+）（圖5A、B）。

在分析了不同疾病狀態下各個B細胞亞群的PBMCs占比（圖5C）和B細胞占比后（圖5D），我們發現，重癥患者的na?ve B細胞和中間記憶B細胞亞群的PBMCs占比明顯高于恢復早期患者，但這兩個亞群的B細胞占比在不同疾病狀態下沒有明顯差異。重癥患者的漿細胞和漿母細胞亞群的PBMCs占比最高，次高為早期恢復患者，均明顯高于輕癥患者和健康對照；在B細胞中，早期恢復患者的漿細胞和漿母細胞亞群的B細胞占比最高，次高為重癥患者，均明顯高于輕癥患者和健康對照。提示重癥患者在B細胞數目上升的同時，B細胞各亞群的比例保持穩定，推測SARS-CoV-2感染對體液免疫的影響有限，體液免疫的正常激活使得na?ve B細胞源源不斷分化成漿細胞和記憶B細胞等效應細胞，促進疾病向康復方向進展。

為了進一步研究SARS-CoV-2感染后B細胞中轉錄組發生的變化，我們分析了疾病期和康復期患者的B細胞與正常對照之間的表達譜變化（圖5E、F）。我們發現，在疾病期、康復期均有和白細胞活化、白細胞黏附、免疫反應調節、外源性肽抗原的處理和呈遞、蛋白質合成等生物學過程相關的基因發生了上調，表明B細胞的功能在疾病期有所增強，且直至康復期都未恢復正常水平。在疾病期，B細胞中與正向調節IL-12生成相關的基因被富集，說明疾病期的B細胞可以顯著增強NK細胞和細胞毒性T細胞的功能。在康復期，B細胞中與凋亡信號相關的基因被富集，這可能是康復期患者外周血中B細胞比例降低的原因之一。

圖5 B細胞各亞群占比及轉錄組特征分析Fig 5 The proportion and transcriptomecharacteristics of subsets of B cell

討 論

盡管尚不清楚SARS-CoV-2感染是否會導致無癥狀攜帶者的后遺癥，但COVID-19通常被認為是一種急性自限性疾病［24］。雖然宿主對急性SARS-CoV-2感染的免疫應答可以清除機體中的病毒，然而不受控制的炎癥反應可能導致COVID-19患者器官和組織的損傷，從而決定了疾病的嚴重程度、進展和結局［2］。已有研究報道了SARS-CoV-2感染導致的先天性和適應性免疫反應的特點［12，16，25］，這有助于我們了解疾病的潛在發病機制。然而，SARS-CoV-2感染后免疫反應的綜合情況難以獲得。為了解決這一問題，我們構建了輕重癥及轉歸階段的COVID-19患者單細胞免疫圖譜，分析了在疾病進展過程中細胞反應的動態變化，揭示了機體抗病毒免疫反應和COVID-19發病機制的關鍵因素。

我們的研究為COVID-19患者的免疫學研究提供了無偏倚的補充。首先，COVID-19患者IL-12相關免疫反應、急性炎癥反應和免疫細胞遷移能力均有所增強。其次，在COVID-19患者中觀察到廣泛的免疫激活，這可以通過增殖性T細胞、漿細胞和炎癥性單核細胞的比例增加以及cDC2、pDC和NK細胞的比例降低來證明。再次，CD8+GZMK+TEM細胞亞群的比例在感染期患者中明顯升高，且輕癥患者的CD8+GZMK+TEM比例高于重癥患者，可能說明該亞群的衰竭會加重病情進展。最后，盡管大多數患者的臨床參數在恢復早期就到了正常范圍，但免疫系統的狀態并未完全恢復，例如NK細胞和XCL 1+NK細胞在恢復晚期仍未正常。我們發現，恢復期患者PBMCs中免疫激活相關的基因仍然上調，或可解釋部分患者在出院后產生的后遺癥。因此，需要進行長期隨訪研究，以確定COVID-19患者免疫完全恢復需要的時間。

之前發現COVID-19重癥患者的支氣管肺泡灌洗液中有大量巨噬細胞［19］，且主要是由外周血中的炎癥性單核細胞分化而來，而不是已有的肺泡巨噬細胞。這類炎癥性單核細胞不僅高表達CD14、FCN1等外周單核細胞標記物，且高表達CCL5、NFKB、AREG等炎癥細胞標志物，具有經典M 1巨噬細胞的基因表達特征。這與我們在外周血中的發現相符，我們在PBMCs中發現，重癥患者CD14+單核細胞顯著擴增，疾病期患者PBMC中炎癥性單核細胞比例也明顯增加，這可以很好地解釋COVID-19患者肺組織中巨噬細胞增多。TLR/IL-1R信號刺激會激活炎癥單核細胞和巨噬細胞［26］。最近的研究表明，抑制TLR/IL-1R信號級聯反映可減輕重癥COVID-19患者的高炎癥狀態［27］。

我們發現，在重癥COVID-19患者中，外周血中NK細胞耗竭，這與已知研究相一致［28］。之前有研究發現，重癥COVID-19患者的NK細胞中NKG2A表達升高，從而抑制CLT細胞的細胞毒性，而外周血中NKG2A降低、NK細胞衰竭逆轉則與COVID-19的恢復成正相關［29］。NK細胞耗竭可能是重癥患者多器官損傷的重要原因。在我們的研究中，還發現了一類高表達XCL1+的NK細胞在重癥患者PBMCs中顯著升高。cDC1表達XCR1，這是XCL 1的唯一受體［30］，NK細胞通過表達XCL 1，進而招募cDC1進入相應組織。cDC1可介導有效識別病毒和細胞內抗原，有抗原遞呈和產生Ⅲ型干擾素的作用，針對病毒感染發揮先天性免疫的作用［31］。因此，重癥患者XCL 1+的NK細胞減少，將嚴重影響cDC1的抗病毒作用，從而影響COVID-19預后。

cDC2不僅是高效的抗原提呈細胞，而且還分泌IL-1、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子α（TNF-α），因此，cDC2細胞可以激活Th1、Th2、Th17和CD8+T細胞［32］；而p DC細胞通過分泌大量Ⅰ型和Ⅲ型干擾素以及細胞因子，特異性應對病毒性感染。然而，我們發現cDC2細胞和pDC細胞在重癥患者PBMCs中比例較低，而在恢復期有升高趨勢，其中cDC2細胞在恢復晚期而pDC細胞在恢復早期，在PBMCs中的比例明顯超過重癥患者。推測是由于重癥患者cDC2細胞和p DC細胞的分化受限，患者對SARS-CoV-2感染的先天免疫力產生缺陷，并導致這兩種細胞在恢復期反跳性升高。

我們發現，在T細胞中，輕癥患者GZMK+CD8+TEM細胞比例明顯高于恢復期患者。此外我們發現，和GZMK-CD8+TEM相比，GZMK+CD8+TEM低表達NKG7、GZMA、GZMB、GNLY等細胞毒性相關基因，因此，輕癥患者擴增的CD8+TEM亞群細胞毒性較低。這可能是輕癥患者的免疫系統得以在抗病毒的同時避免免疫損傷的原因。增殖性CD8+T/NK細胞的T細胞占比在重癥患者中顯著上升，明顯高于正常對照。在其余T細胞亞群中，我們并未發現重癥患者T細胞中占比升高的細胞亞群。有報道［16］稱，在重癥患者PBMCs中CD4+T細胞和CD8+T細胞的絕對數目均有降低，因此可以推測，重癥患者T細胞的減少是由于破壞或凋亡增加所引起，并導致T細胞增殖加快。

我們注意到，與恢復早期患者相比，重癥患者PBMCs中初始B細胞和中間型B細胞的比例明顯升高，據此推測重癥患者的免疫系統加快了B細胞的生成和轉化，從而增強機體抗病毒的能力。因此，我們也能看到重癥患者PBMCs中漿細胞/漿母細胞的擴增。盡管早期恢復患者PBMCs中初始B細胞和中間型B細胞的比例較低，但其漿細胞/漿母細胞的比例卻高于健康對照和輕癥患者，僅次于重癥患者PBMCs。我們推斷，輕癥患者由于病毒負荷較低，抗原遞呈不足，導致體液免疫激活延遲，在恢復早期才有一定的漿細胞；而重癥患者體液免疫持續激活，在恢復早期仍保持足夠多的漿細胞。

本研究存在局限性：樣本量相對較小，且來自不同的實驗室。因此，批次效應難以控制，需要對更多COVID-19患者的數據進行研究，以便確定不同細胞類型的免疫特征與疾病結局之間的因果關系。

綜上所述，本研究中綜合性高分辨率的分析結果為研究COVID-19發生發展的復雜動態免疫反應提供了基礎，為深入了解COVID-19患者的外周血淋巴細胞提供了資源，并為設計減輕COVID-19損傷的療法提供了幫助。

作者貢獻聲明王正 論文構思、撰寫和修訂，數據統計和分析。張倩月 數據采集和分析，論文修訂。宋懷東 論文構思和修訂，數據分析指導。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。