構建LPS誘導的急性炎癥小鼠模型用于IDO1抑制劑藥效動力學評價

施 磊 郭磊磊 楊 丹 楊 青

（復旦大學生命科學學院生物化學與分子生物學系 上海 200438）

吲 哚 胺2，3雙 加 氧 酶1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）是 沿 犬 尿 氨 酸 通 路（kynurenine pathway，KP）分解代謝人體必需氨基酸 色 氨 酸（tryptophan，Trp）生 成 犬 尿 氨 酸（kynurenine，Kyn）等中間代謝物及終產物輔酶NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）的首個限速酶［1］。IDO1在哺乳動物的中樞神經系統、附睪、腸、胸腺、呼吸道、脾臟等組織中均有表達［2］。KP異常與神經退行性疾病、抑郁、心血管疾病和惡性腫瘤等疾病的病理機制密切相關，在上述疾病患者中IDO1高表達或過度活化伴KP上調多見［3-6］。阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）患者以及抑郁癥患者血清中IDO1活性高于健康個體［7-8］；IDO1活性與動脈粥樣硬化的早期標志物頸動脈內膜/中層厚 度（intima media thickness，IMT）呈 顯 著 正 相關［9］。IDO1高表達還與多種腫瘤的不良預后正相關［10］。近年，IDO1在腫瘤免疫逃逸中的作用也受到關注。在腫瘤微環境中，高表達的IDO1消耗Trp，蓄積Kyn，誘導效應T細胞凋亡及功能障礙［11］，活化調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）［12］，營造免疫抑制的微環境，進而造成腫瘤免疫逃逸。因此，IDO1是AD、抑郁、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病治療的重要靶標。

開發IDO1抑制劑靶向IDO1阻斷KP是疾病治療的重要策略。研究發現抑制IDO1可改善AD小鼠認知行為，具有一定的治療作用［13］。IDO1抑制劑1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophau，1-MT）可下調抑郁小鼠血清中IDO1活性，減輕抑郁行為［14］。IDO1抑制劑在多種腫瘤小鼠模型中展現出良好的抗腫瘤作用。對黑色素瘤B16荷瘤小鼠連續14天腹腔注射75 mg/kg IDO1抑制劑5I，腫瘤抑制率達到75%［15］；灌胃給予30或100 mg/kg IDO1抑制劑INCB024360均能顯著抑制大腸癌CT 26荷瘤小鼠的腫瘤生長［16］。多個IDO1抑制劑單用或聯合其他藥物用于癌癥治療的研究也已進入臨床試驗階段，如Indoximod、PF-06840003、Epacadostat、Nnavoximod、KHK 2455和BMS-986205等。

IDO1抑制劑的研發必須開展藥效動力學評價，即研究IDO1抑制劑對KP的阻斷作用。有研究以Kyn水平的降低作為IDO1活性被抑制的衡量標準［15］，更多研究以Kyn與Trp的比值（即Kyn/Trp）減小作為標準，后者能更準確地反映IDO1活性的改變?，F有的用于IDO1抑制劑藥效動力學評價的動物模型有na?ve鼠［15］和荷瘤小鼠［17］。使用na?ve鼠進行IDO1抑制劑藥效動力學評價一般采用單次給藥，故實驗耗時短。但是na?ve鼠處于正常生理狀態，本底IDO1水平較低，使用抑制劑后引起Kyn濃度或（Kyn/Trp）×100的改變非常有限，不能準確反映IDO1抑制劑對IDO1活性的抑制效力。荷瘤小鼠的IDO1活性高于na?ve鼠的IDO1活性，但用于IDO1抑制劑藥效動力學評價實驗周期較長。乳腺癌4T 1荷瘤小鼠和肺癌LLC荷瘤小鼠用于實驗需耗時21天和18天［18-19］。因此，有必要對現有的IDO1抑制劑藥效動力學評價的動物模型進行改進，建立短時間內顯著上調體內IDO1活性的動物模型，以提高實驗效率和結果準確性。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導炎癥反應，通過激活TLR4/NF-kB信號通路上調小鼠體內IDO1活性［20-21］。LPS的給藥方式主要有腹腔注射［22］、尾靜脈注射［23］、鼻飼［24］等。本文選用昆明鼠及C57BL/6小鼠，通過尾靜脈注射及腹腔注射兩種不同的給藥方式給予小鼠LPS。造模以后，對模型小鼠灌胃給予IDO1抑制劑TQ016，給藥后不同時間點取血，HPLC檢測小鼠血清中Kyn和Trp含量，用（Kyn/Trp）×100反映IDO1活性。研究LPS誘導的炎癥小鼠模型用于IDO1抑制劑藥效動力學評價的可行性，評價IDO1抑制劑TQ016的藥效動力學。

材料和方法

動物選取昆明鼠45只和C57BL/6鼠225只（5周齡，雌性，上海杰思捷實驗動物有限公司），飼養過程及實驗過程符合標準。

試劑和藥品羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（上海昌為醫藥輔料有限公司），L-1-MT、LPS（美國Sigma-aldrich公司），L-Trp、L-Kyn、色譜級甲醇、色譜級乙腈（阿拉丁試劑上海有限公司），TQ016、乙酸鈉（上海文旻生化科技有限公司），冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司），高氯酸（鑫源化工有限公司），小鼠飼料及墊料（上海斯萊克實驗動物有限公司）。

儀器和設備渦旋儀（美國Thermo Scientific公司），電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司），超聲波細胞粉碎儀（寧波海曙科生超聲設備有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司），SW-CJ-1FD潔凈工作臺（蘇州凈安泰空氣技術有限公司），Legend Micro 17R高速離心機（美國Thermo Scientific），高效液相色譜儀、C18柱（美國Agilent公司）。

溶液及藥物配制

LPS溶液 配制0.9%NaCl溶液（生理鹽水），用0.22μm水相濾頭過濾。將5 mg/mL LPS母液用生理鹽水稀釋后用于尾靜脈注射和腹腔注射。

0.5%CMC-Na溶液 100 mL生理鹽水經0.22μm水相濾頭過濾，50℃水浴加熱，稱取0.5 g CMC-Na加入其中，完全溶解后于4℃保存。

L-1-MT溶液 稱取34.2 mg L-1-MT置于4 mL EP管中，加入2 mL 0.5%CMC-Na溶液，于超聲波細胞粉碎機中超聲10 s，冰浴冷卻，循環操作，直至L-1-MT完全溶解，補加0.5%CMC-Na溶液至3.8 mL，封口膜封口，于超聲波清洗器中超聲10 min，4℃保存。按小鼠體重18 g給藥0.2 mL計算，劑量為100 mg/kg。

TQ016溶液 配制方法同L-1-MT。按小鼠體重20 g給藥0.2 mL計算，劑量分別為25、50和100 mg/kg。

炎癥小鼠模型構建昆明鼠尾靜脈注射0.66 mg/kg LPS，24 h后用于給藥實驗。C57BL/6小鼠腹腔注射5或8 mg/kg LPS，24 h后用于給藥實驗。

小鼠給藥昆明鼠隨機分為4組：1個對照組和3個LPS造模組（給藥劑量約為0.66 mg/kg）。對照組（5只）和LPS組（16只）灌胃給予0.5%CMC-Na，LPS+L-1-MT組（6只）和LPS+TQ016組（18只）分別灌胃給予100 mg/kg L-1-MT和100 mg/kg TQ016。各組小鼠于給藥后40 min、2 h和4 h摘眼球取血。

C57BL/6小鼠隨機分為5組：1個對照組和4個LPS造模組（給藥劑量為5或8 mg/kg）。對照組（6只）、5 mg/kg LPS組（8只）和8 mg/kg LPS組（8只）灌胃給予0.5%CMC-Na，5 mg/kg LPS+L-1-MT組（8只）和8 mg/kg LPS+L-1-MT組（8只）灌胃給予100 mg/kg L-1-MT。各組小鼠于給藥后4和12 h摘眼球取血。

C57BL/6小鼠隨機分為3組：1個對照組和2個LPS造模組（給藥劑量為5 mg/kg）。對照組（20只）和LPS組（21只）灌胃給予0.5%CMC-Na，LPS+TQ016組（27只）灌胃給予100 mg/kg TQ016。各組小鼠于給藥后1、6、12、24和30 h摘眼球取血。

C57BL/6小鼠隨機分為5組：1個對照組和4個LPS造模組（給藥劑量為5 mg/kg）。對照組（20只）和LPS組（21只）灌胃給予0.5%CMC-Na，LPS+25 mg/kg TQ016組（26只）、LPS+50 mg/kg TQ016組（26只）和LPS+100 mg/kg TQ016組（26只）分別灌胃給予25、50和100 mg/kg TQ016。各組小鼠于給藥后1、6、12、24和30 h摘眼球取血。

小鼠血清制備小鼠全血室溫靜置1 h，4℃下900×g離心10 min，吸取上清，得粗血清。將粗血清按上述條件再次離心10 min，吸取上清，得純血清。加入等體積5%高氯酸溶液，渦旋混勻30 s，室溫靜置15 min，室溫下16 200×g離心10 min。取上清，加入1/2體積的色譜級甲醇，渦旋混勻2 min，室溫下16 200×g離心10 min。取上清，用0.22μm水系濾膜過濾，向標記好的內襯管中加入200μL處理好的血清，4℃保存，待HPLC檢測。

HPLC檢測條件C18柱（250 nm×4.6 mm，5μm），柱溫25℃，流動相為15 mmol/L乙酸-乙酸鈉溶液（pH=3.6）∶乙腈=94∶6，流速1 mL/min，進樣量20μL。檢測波長：Trp為280 nm，Kyn為360 nm。

統計學分析數據統計采用GraphPad Prism6.0軟件，所有數據均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

尾靜脈注射LPS小鼠的IDO1活性上調昆明鼠尾靜脈注射0.66 mg/kg LPS造模24 h后用于給藥實驗（圖1）。模型小鼠血清中Trp含量下調（2 h：P=0.012 9，4 h：P=0.022 7），Kyn含量［40 min：P=0.038 6，2 h：F（4，4）=4.871，P=0.026 3］及IDO1活性上調［40 min：P=0.032 8，2 h：P=0.002 1，4 h：F（2，11）=3.94 1，P=0.042 3］。尾靜脈注射0.66 mg/kg LPS可上調小鼠血清中IDO1活性，造模成功。

IDO1抑制劑對尾靜脈注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用模型小鼠灌胃給予IDO1抑制劑L-1-MT 2 h后，被LPS下調的Trp含量略恢復（圖1A），被LPS上調的Kyn含量［F（4，5）=4.399，P=0.030 0］（圖1B）和IDO1活性［F（4，5）=6.377，P=0.006 8］，（圖1C）顯著降低。說明L-1-MT在灌胃給藥2 h后具有明顯的IDO1活性抑制作用。

模型小鼠灌胃給予IDO1抑制劑TQ016 40 min后，被LPS下調的Trp含量略恢復；2、4 h后，被LPS下調的Trp含量顯

著上調［2 h：P=0.027 9，4 h：F（3，4）=1.389，P=0.005 2］（圖1D）。TQ016對Kyn含量無明顯影響（圖1E）。模型小鼠灌胃給予TQ016 40 min、2 h和4 h后，被LPS上調的IDO1活性降低且在TQ016灌胃2 h后差異有統計學意義［F（4，5）=2.585，P=0.035 3］（圖1F）。尾靜脈注射0.66 mg/kg LPS可構建IDO1活性上調的模型小鼠，IDO1抑制劑L-1-MT和TQ016灌胃給藥2 h后可顯著抑制模型小鼠體內被LPS上調的IDO1活性。

圖1 IDO1抑制劑對尾靜脈注射LPS小鼠血清中IDO1活性的抑制作用Fig 1 Effects of IDO1 inhibitors on IDO1 activity in the serum of mice challenged with LPS

腹腔注射LPS小鼠的IDO1活性上調與對照組相比，腹腔注射5、8 mg/kg LPS均能下調C57BL 16小鼠血清中Trp含量（圖2A、2D），上調Kyn含量（圖2B、2E）和顯著上調IDO1活性［5 mg/kg LPS組（圖2C）：4 h，F（3，2）=8.627，P=0.011 9；12 h，F（2，2）=1.214，P=0.020 8；8 mg/kg LPS組（圖2F）：4 h，F（2，2）=37.900，P=0.000 4；12 h，F（3，2）=11.010，P=0.010 8］。

L-1-MT對腹腔注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用5 mg/kg LPS造模組灌胃給予L-1-MT 4 h后，被LPS下調的Trp含量可恢復（圖2A），被LPS上調的Kyn含量［F（3，3）=1.739，P=0.016 9］（圖2B）和IDO1活性［F（3，3）=5.417，P=0.010 9］（圖2C）顯著降低。灌胃給予L-1-MT 12 h后，血清中Trp、Kyn含量和IDO1活性均無明顯變化（圖2A～2C），可能與L-1-MT的半衰期和藥代動力學性質有關。

8 mg/kg LPS造模組灌胃給予L-1-MT 4 h后，血清中Trp含量無明顯變化（圖2D），被LPS上調的Kyn含量顯著降低［F（2，2）=3.647，P=0.026 6］（圖2E），被LPS上調的IDO1活性降低（圖2F）。灌胃給予L-1-MT 12 h后，血清中Trp和Kyn含量以及IDO1活性均無明顯變化（圖2D～2F）。綜合以上實驗結果，我們選用5 mg/kg LPS腹腔注射用于評價TQ016的藥效動力學。

圖2 L-1-MT對腹腔注射LPS小鼠血清中IDO1活性的抑制作用Fig 2 Effect of IDO1 inhibitor L-1-MT on IDO1 activity in the serum of mice challenged with LPS

TQ016對腹腔注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用5 mg/kg LPS造模組小鼠在腹腔注射LPS 24 h后體重下降（1.57±0.57）g，對照組小鼠在腹腔注射生理鹽水24 h后體重增加了（0.64±0.57）g。

與對照組小鼠相比，在給藥后不同時間點，LPS造模組小鼠血清中Trp含量均下降（圖3A），Kyn含量均顯著增長（1 h：P=0.042 8，6 h：P=0.019 4，12 h：P=0.019 4，24 h：P=0.005 3，30 h：P=0.003 5）（圖3B），IDO1活性在給藥后1、6、12、24和30 h分別增長3.47、5.84、1.75、3.69和5.41倍，差異均有統計學意義（1 h：P=0.014 7，6 h：P=0.003 3，12 h：P=0.014 7，24 h：P=0.003 0，30 h：P=0.003 0）（圖3C）。腹腔注射LPS小鼠灌胃給予TQ016后1、6、12、24和30 h，被LPS上調的IDO1活性分別下降36.67%、43.46%、51.70%、45.90%和51.61%，在6、12、24和30 h差 異 有 統 計 學 意 義［6 h：P=0.0159；12 h：F（3，4）=3.971，P=0.005 2；24 h：F（3，5）=1.886，P=0.004 8；30 h：F（5，4）=1.835，P=0.000 5］（圖3C）。以上結果再次說明腹腔注射LPS用于上調小鼠血清中IDO1活性的可行性，此小鼠模型適用于IDO1抑制劑的藥效動力學評價。IDO1抑制劑TQ016具有良好的IDO1活性抑制作用。

圖3 TQ016對腹腔注射LPS小鼠血清中IDO1活性的抑制作用Fig 3 Effect of IDO1 inhibitor TQ016 on IDO1 activity in theserum of mice challenged with LPS

不同劑量TQ016對腹腔注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用與對照組相比，LPS組小鼠血清中Trp含量下調（圖4A），Kyn含量上調（圖4B），IDO1活性顯著上調（1 h：P=0.009 0，6 h：P=0.001 4，12 h：P=0.037 7，24 h：P=0.006 1，30 h：P=0.002 1）（圖4C）。TQ016對LPS下調的Trp含量無明顯影響（圖4A）。當TQ016為100 mg/kg時，灌胃給予1、6、24和30 h后，被LPS上調的Kyn含量顯著降低［1 h：F（3，3）=10.100，P=0.030 3；6 h：F（3，4）=2.812，P=0.039 4；24 h：F（4，3）=8.392，P=0.0208；30 h：F（5，4）=1.493，P=0.000 2］（圖4B）。不同劑量TQ016灌胃1、6、12、24和30 h后，被LPS上調的IDO1活性均不同程度下降且呈劑量效應。當TQ016為100 mg/kg時，灌胃給予1、6、12、24和30 h后，被LPS上調的IDO1活性均顯著降低［1 h：P=0.028 6；6 h：F（3，4）=1.662，P=0.008 4；12 h：F（4，2）=2.290，P=0.012 4；24 h：F（4，3）=12.560，P=0.002 0；30 h：F（5，4）=2.114，P=0.000 5］（圖4C）。以上結果說明IDO1抑制劑TQ016具有良好的IDO1活性抑制作用并呈劑量效應。

圖4 不同劑量TQ016對腹腔注射LPS小鼠血清中IDO1活性的抑制作用Fig 4 Dose-dependent effect of TQ016 on IDO1 activity in the serum of mice challenged with LPS

討 論

Na?ve鼠用于IDO1抑制劑藥效動力學評價一般采用單次給藥，如na?ve C57BL/6小鼠單次皮下注射100 mg/kg IDO1抑制劑5I，血清中Kyn含量從（1.10±0.17）μmol/L下降到（0.45±0.20）μmol/L［15］，na?ve C57BL/6小鼠單次灌胃給予50 mg/kg IDO1抑制劑INCB024360，血清中Kyn含量從給藥前約1.50μmol/L下降到給藥8 h后的0.50μmol/L左右［16］。因此，實驗耗時短。但是，na?ve鼠處于正常生理狀態，本底IDO1活性較低。LPS可誘導炎癥反應，上調小鼠體內IDO1活性。

本研究使用尾靜脈注射和腹腔注射兩種方式給予小鼠LPS。尾靜脈注射需要將老鼠固定、鼠尾拉直，注射時的進針角度盡量平行于鼠尾。與尾靜脈注射相比，腹腔注射相對容易操作。實驗結果發現尾靜脈注射0.66 mg/kg LPS或腹腔注射5 mg/kg LPS均可顯著上調小鼠血清中IDO1活性，適用于造模。其中，LPS誘導前昆明鼠本底的Trp、Kyn含量以及（Kyn/Trp）×100為80.00～90.00μmol/L、1.00μmol/L和1.30，誘導后為50.00～60.00μmol/L、1.50～2.00μmol/L和3.00～4.00。LPS誘 導 前C57BL/6小鼠本底Trp、Kyn含量以及（Kyn/Trp）×100為100.00～150.00μmol/L、0.30～1.30μmol/L和0.30～0.90，誘 導 后 為70.00～100.00μmol/L、2.00～4.00μmol/L和2.00～4.00。兩種小鼠本底Trp、Kyn含量以及（Kyn/Trp）×100相近，LPS可上調兩種小鼠血清中IDO1活性。

與na?ve鼠相比，LPS誘導的小鼠具有較高的IDO1活性。與構建荷瘤小鼠相比，使用LPS誘導小鼠實驗操作簡單易行，無需進行細胞培養、傳代以及細胞皮下接瘤等實驗操作，只需為小鼠尾靜脈注射或腹腔注射LPS，即可短時間內顯著上調小鼠血清中IDO1活性。實驗耗時明顯短于構建荷瘤小鼠所需時間，節省了大量的時間、人力成本。LPS將體內（Kyn/Trp）×100從0.50左右上調至1.80～2.60，具有與荷瘤小鼠相當甚至較高的IDO1活性。因此，LPS誘導構建的急性炎癥小鼠模型適用于IDO1抑制劑藥效動力學評價。

接下來，我們評價了IDO1抑制劑L-1-MT和TQ016的藥效動力學。采用尾靜脈注射LPS造模時，我們檢測了IDO1抑制劑在短時間內（40 min、2 h、4 h）的藥效動力學效果；采用腹腔注射LPS建模時，我們檢測了L-1-MT在4、12 h的藥效動力學效果，以及TQ016在長時間內（≤30 h）的藥效動力學效果。實驗結果發現L-1-MT和TQ016在灌胃給予2 h后對尾靜脈注射LPS小鼠具有明顯的IDO1活性抑制作用。與此類似，有研究表明na?ve小鼠腹腔注射100 mg/kg IDO1抑制劑5I，給藥后2.5 h達到最大的血清Kyn抑制效果［15］。腹腔注射LPS小鼠灌胃給予L-1-MT 4 h后，被LPS上調的IDO1活性顯著下降；灌胃給予TQ016后1、6、12、24和30 h，被LPS上調的IDO1活性分別下降了36.67%、43.46%、51.70%、45.90%和51.61%（37%～50%），并且在6、12、24和30 h這些時間點具有顯著性。一些處于臨床試驗階段的IDO1抑制劑的動物水平的藥效動力學研究也有報道，如口服20 mg/kg NLG919可將乳腺癌4T 1荷瘤小鼠血清中IDO1活性下調50%左右［18］，腹腔注射80 mg/kg Epacadostat可將肺癌LLC荷瘤小鼠血清中IDO1活性下調50%左右［19］。本實驗的結果表明TQ016和這些IDO1抑制劑具有水平相近的IDO1活性抑制作用。最后，我們選用25、50和100 mg/kg這3種不同的TQ016灌胃劑量。實驗結果發現TQ016對LPS上調的小鼠血清中IDO1活性具有抑制作用并呈劑量效應。

綜上，尾靜脈注射0.66 mg/kg LPS或腹腔注射5 mg/kg LPS均可短時間內顯著上調小鼠血清中IDO1活性。構建該動物模型僅需尾靜脈注射或腹腔注射LPS，實驗操作相較于構建荷瘤小鼠簡單易行，實驗耗時短，且LPS上調的IDO1活性與荷瘤小鼠IDO1活性相當。因此，LPS誘導的小鼠模型適用于IDO1抑制劑的藥效動力學評價。利用該模型對IDO1抑制劑TQ016進行藥效動力學評價，結果發現TQ016和目前處于臨床試驗的IDO1抑制劑具有相當的IDO1活性抑制作用，并呈劑量效應。本研究可為IDO1抑制劑的研究提供一個科學、高效的研究工具，有助于IDO1抑制劑的新藥研發。

作者貢獻聲明施磊 實驗操作，數據統計和分析，論文構思和撰寫。郭磊磊，楊丹 實驗操作，數據收集。楊青 論文構思和撰寫。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。