慢性晝夜節(jié)律紊亂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及其致病機(jī)制研究進(jìn)展*

劉薇薇 于 洋 聞德亮

(中國醫(yī)科大學(xué)健康科學(xué)研究院，沈陽 110122)

生物鐘或稱晝夜節(jié)律，是生物體以適應(yīng)環(huán)境周期性變化而形成的內(nèi)在節(jié)律。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，身體可以通過感知外部線索(主要是光)來重新調(diào)整自己的生物鐘。生物鐘主要包括中央生物鐘和外圍生物鐘。中央生物鐘位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)，被認(rèn)為是晝夜節(jié)律的主要起搏器，通過感知環(huán)境中的光并整合信息形成24 h晝夜節(jié)律。此外，位于SCN的中央生物鐘通過激素或突觸將信號(hào)傳遞給外周生物鐘，控制身體的晝夜節(jié)律。外周生物鐘廣泛分布在腸道、胰腺、心臟、肝、骨骼肌和腎等組織中，在晝夜節(jié)律中部分受中樞生物鐘控制，同時(shí)它有自己的振蕩器來調(diào)節(jié)各種組織器官的功能[1-3]。大多數(shù)生物鐘成分是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，研究最廣泛的時(shí)鐘基因包括Bmal1(brain and muscle arnt like protein1，Bmal1)、Clock(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)、Per1/2/3(Periods1/2/3，Per)和Cry1/2(Cryptochromes1/2，Cry)[4]。除了光，膳食營養(yǎng)[5-6]，睡眠[7]和運(yùn)動(dòng)[8]都會(huì)影響生物鐘的調(diào)節(jié)作用。已知晝夜節(jié)律紊亂會(huì)導(dǎo)致包括代謝性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展，而其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，本文總結(jié)了多個(gè)晝夜節(jié)律紊亂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型便于相關(guān)研究的開展及機(jī)制深入探討。

1 晝夜節(jié)律紊亂動(dòng)物模型構(gòu)建

1.1 核心生物鐘基因敲除的干預(yù)模型

哺乳動(dòng)物生物鐘由幾個(gè)核心的時(shí)鐘基因組成，包括Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2，它們的蛋白質(zhì)產(chǎn)物對于晝夜節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)至關(guān)重要[4]，任何核心時(shí)鐘基因的敲除都會(huì)破壞晝夜節(jié)律生理機(jī)能，進(jìn)而導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂。采用晝夜核心基因敲除來構(gòu)造晝夜節(jié)律紊亂模型如：(1)Per突變倉鼠模型：如第一個(gè)被鑒定為晝夜節(jié)律突變體的哺乳動(dòng)物是Per突變體倉鼠，與野生型24 h節(jié)律相比，它的晝夜節(jié)律為20 h[9]；(2) 肝細(xì)胞特異性Bmal1基因敲除小鼠模型和同窩小鼠對照研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1肝細(xì)胞特異性基因敲除小鼠表現(xiàn)為肝糖原合成功能紊亂[10]；(3) 化學(xué)試劑或藥物誘導(dǎo)Bmal1缺失小鼠模型，小鼠接受每天3次4 mg 他莫昔芬的腹腔注射，會(huì)導(dǎo)致Bmal1的缺失小鼠模型；(4) 通過物理射線方式誘導(dǎo)Bmal1缺失小鼠模型，使用伽馬射線照射可得到Bmal1功能喪失小鼠突變體[11]。Bmal1-/-的小鼠會(huì)改變葡萄糖和胰島素的分泌[12-13]，增加循環(huán)脂肪酸的濃度，從而導(dǎo)致肝和骨骼肌中形成異位脂肪[14]，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌蛇x擇不同手段針對不同的晝夜核心時(shí)鐘基因進(jìn)行動(dòng)物造模。

1.2 光照位移誘導(dǎo)中央生物鐘紊亂模型

SCN中央生物鐘是整個(gè)生物鐘的核心部分，處于獨(dú)立自我維持振蕩器層次結(jié)構(gòu)的頂部，光是SCN中央生物鐘最主要的外部影響因素[1]。光信息直接從含有內(nèi)在光敏性黑視蛋白的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞通過視網(wǎng)膜下丘腦束到達(dá)SCN, 然后通過神經(jīng)、體液和系統(tǒng)信號(hào)的組合將信息傳遞到大腦和身體的其余部分，帶動(dòng)外周時(shí)鐘[15]。外部光照條件頻繁變化會(huì)損害中央分子生物鐘適應(yīng)穩(wěn)定節(jié)奏的能力，因此可采用不同光照位移誘導(dǎo)中央生物鐘紊亂來構(gòu)造慢性晝夜節(jié)律紊亂小鼠模型：(1) 單純光照前移模型：如在Thaiss實(shí)驗(yàn)中，通過嚴(yán)格明暗循環(huán)照明，使8～9周的C57BL/6J小鼠具有穩(wěn)定的晝夜節(jié)律，然后進(jìn)行每3 d 8 h的光照相位的位移，模擬8 h的時(shí)差情況[16]；(2) 混合類型光照位移模型：Herrero的實(shí)驗(yàn)[17]中分3組進(jìn)行不同方式的光照位移，高級(jí)組每5 d相位提前6 h，延遲組每5 d相位延遲6 h，高級(jí)-延遲組每5 d交替進(jìn)行6 h 的相位提前和延遲。結(jié)果顯示，3組中只有高級(jí)組的血清葡萄糖、胰島素和瘦素水平最先下降，同時(shí)高級(jí)組的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)節(jié)律表現(xiàn)出最大改變，組織學(xué)檢查顯示脂質(zhì)積聚，并顯示棕色脂肪白色化，通過分析棕色脂肪與白色脂肪相關(guān)代謝物以及基因的表達(dá)顯示高級(jí)組小鼠有明顯肥胖趨勢。由此說明不同的光線強(qiáng)度與波長也可能引起不同程度的時(shí)鐘紊亂。

1.3 改變食物種類誘導(dǎo)晝夜節(jié)律紊亂模型

高脂肪飲食(high fat diet，HFD)可調(diào)控晝夜節(jié)律基因、調(diào)節(jié)時(shí)鐘轉(zhuǎn)錄因子的核受體和參與下丘腦、肝和大腦中燃料利用的時(shí)鐘控制基因的表達(dá)，因此可通過高脂肪飲食進(jìn)行時(shí)鐘紊亂動(dòng)物造模。如將4周齡的小鼠隨機(jī)分為普通飲食和高脂肪飲食(45%熱量來自脂肪，20% 熱量來自蛋白質(zhì)，以及35%熱量來自碳水化合物)，喂食6周，結(jié)果表明，高脂肪飲食可以延長小鼠自由活動(dòng)的時(shí)間，同時(shí)減弱了飲食行為的晝夜模式，與正常飲食小鼠相比，高脂飲食小鼠在光照期間攝食增加而黑暗期間攝食減少，機(jī)制分析認(rèn)為高脂飲食破壞了外周時(shí)鐘基因表達(dá)和功能核激素受體的24 h表達(dá)模式，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)核受體和下游代謝通路在肝與脂肪細(xì)胞的外周生物鐘中不再同步，證明高脂飲食造成晝夜節(jié)律紊亂[18]。

1.4 改變進(jìn)食行為影響晝夜節(jié)律紊亂模型

調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律振蕩器不僅存在于SCN中，也存在于大多數(shù)外周組織中，可以通過限時(shí)進(jìn)食誘導(dǎo)外圍節(jié)律振蕩。使用10至16周齡的小鼠[19]，保持每天12 h正常光照時(shí)間，將小鼠隨機(jī)分為白天喂食(早上6點(diǎn)到下午6點(diǎn)進(jìn)食)，夜間喂食(下午6點(diǎn)到第2天早上6點(diǎn)進(jìn)食)。發(fā)現(xiàn)限制進(jìn)食會(huì)特別影響肝晝夜節(jié)律和膽固醇7α羥化酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶mRNA的積累，并對除肝以外其他臟器，如腎、心臟、胰腺等器官生物鐘也產(chǎn)生了影響。而對SCN的體內(nèi)電生理記錄測量分析發(fā)現(xiàn)，SCN起搏器的相位沒有任何改變。因此，改變進(jìn)食時(shí)間會(huì)導(dǎo)致外圍晝夜節(jié)律振蕩器與中央SCN起搏器分離，并且不對中央起搏器產(chǎn)生影響。

2 晝夜節(jié)律紊亂參與生理信號(hào)調(diào)控

2.1 晝夜節(jié)律系統(tǒng)參與維持能量穩(wěn)態(tài)

大約10% 的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組顯示晝夜節(jié)律振蕩[20]。在已鑒定的節(jié)律基因中，許多基因在協(xié)調(diào)營養(yǎng)代謝方面具有特定作用[21]。例如，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和胰高血糖素受體，以及參與糖代謝和膽固醇生物合成的多種酶，代謝相關(guān)的激素，如胰高血糖素、胰島素、生長素釋放肽、瘦素和皮質(zhì)酮都會(huì)有節(jié)奏地表達(dá)和振蕩[22]。下丘腦內(nèi)有節(jié)律性控制促食欲信號(hào)，包括神經(jīng)肽Y、甘丙肽和阿片黑素前體等協(xié)調(diào)代謝信號(hào)的關(guān)鍵區(qū)域。

2.2 生物鐘核心基因的破壞影響新陳代謝

Bmal1-/-小鼠增加循環(huán)脂肪酸的濃度，導(dǎo)致在肝和骨骼肌中形成異位脂肪。當(dāng)Bmal2-/-的Bmal-/-小鼠的節(jié)律性得到恢復(fù)時(shí)，胰島素分泌與活動(dòng)模式也會(huì)相繼恢復(fù)[23]。此外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中回補(bǔ)Bmal1可以恢復(fù)運(yùn)動(dòng)活動(dòng)節(jié)律，但不會(huì)改變新陳代謝的節(jié)奏[24]。這表明外周組織中的破壞對于代謝變化很重要。Per2基因的單一破壞會(huì)改變葡萄糖穩(wěn)態(tài)，擾亂進(jìn)食和糖皮質(zhì)激素節(jié)律，并導(dǎo)致體質(zhì)量顯著增加[25]。

2.3 外周組織中時(shí)鐘功能的喪失影響新陳代謝

改變肝和骨骼肌中的時(shí)鐘基因表達(dá)會(huì)損害葡萄糖加工并改變胰島素分泌[26]。胰腺Bmal1的缺失會(huì)降低其胰島素分泌能力，這與小鼠活動(dòng)或進(jìn)食節(jié)律變化無關(guān)。肝特異性Bmal1缺失小鼠在禁食階段表現(xiàn)出低血糖、過度的葡萄糖清除和肝葡萄糖調(diào)節(jié)基因的節(jié)律性表達(dá)喪失[27-28]。脂肪細(xì)胞中Bmal1的缺失會(huì)改變?nèi)粘＿M(jìn)食節(jié)律并導(dǎo)致肥胖[29]。

3 晝夜節(jié)律紊亂引起疾病的發(fā)病機(jī)制

3.1 晝夜節(jié)律紊亂對中樞神經(jīng)類疾病的影響

晝夜節(jié)律紊亂的直接表現(xiàn)是睡眠的改變，研究發(fā)現(xiàn)Cry1與核心生物鐘基因的顯性編碼變異相關(guān)，轉(zhuǎn)錄抑制Clock和Bmal1表達(dá)，Cry1基因突變會(huì)導(dǎo)致延長晝夜節(jié)律的周期，從而導(dǎo)致延遲睡眠障礙[30]。晝夜節(jié)律和睡眠障礙也是各種神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志，如阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病[31]。Bmal1缺失小鼠呈現(xiàn)顯著的神經(jīng)退行性疾病表型，包括嚴(yán)重的自發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、氧化損傷增加、突觸變性、腦功能連接受損、學(xué)習(xí)和記憶受損、海馬神經(jīng)發(fā)生改變和癲癇閾值降低[32]。相關(guān)機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面: (1) 破壞晝夜節(jié)律功能可能會(huì)使大腦更容易遭受氧化損傷，從而加劇氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元死亡。(2) 由于生物鐘紊亂引起的炎性反應(yīng)，促使星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞容易發(fā)生神經(jīng)變性。(3) 晝夜節(jié)律時(shí)鐘振蕩使蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解，也表現(xiàn)出相應(yīng)的振蕩節(jié)律，生物鐘節(jié)律紊亂同時(shí)也抑制了大腦通過自噬清除病原性蛋白質(zhì)、預(yù)防神經(jīng)變性的功能[33]。

3.2 晝夜節(jié)律紊亂對心血管類疾病的影響

在心臟中，大約13%的基因和8%蛋白質(zhì)的表達(dá)具有節(jié)律性[34]。每天心肌細(xì)胞依次經(jīng)歷3個(gè)階段：(1) ATP 生成階段以促進(jìn)活動(dòng)期的收縮功能；(2) 活動(dòng)期結(jié)束時(shí)的營養(yǎng)儲(chǔ)存階段；(3) 生長/修復(fù)階段/ 睡眠期[35]。動(dòng)物分子鐘的中斷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管疾病，例如，小鼠中的Bmal1敲除會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病，降低每搏輸出量和射血分?jǐn)?shù)，并導(dǎo)致小鼠心力衰竭[36]。生物鐘還通過調(diào)節(jié) Kruppel樣因子15的節(jié)律，將心臟中的離子平衡控制在健康范圍內(nèi)，缺乏或過度都會(huì)增加室性心律失常易感性[37]。

3.3 晝夜節(jié)律紊亂對胰腺的損傷

研究發(fā)現(xiàn)胰島中的時(shí)鐘中斷會(huì)導(dǎo)致胰島素釋放不足和2型糖尿病。在離體胰腺分化的β細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)被抑制的晝夜節(jié)律信號(hào)會(huì)嚴(yán)重阻斷肽胞吐作用并導(dǎo)致胰島素釋放不足[38]。此外，晝夜節(jié)律紊亂會(huì)加重糖尿病患者基礎(chǔ)胰島素分泌障礙[39]。在飲食誘導(dǎo)肥胖下，β細(xì)胞特異性過表達(dá)Bmal1，會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)出現(xiàn)增強(qiáng)的胰島生物鐘振幅，改善肥胖及相關(guān)代謝性疾病[40]。

3.4 晝夜節(jié)律紊亂對肝的損傷

線粒體動(dòng)力學(xué)(特別是分離融合和線粒體自噬)受晝夜節(jié)律的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器Bmal1調(diào)控[41]。當(dāng)生物鐘的Bmal1功能喪失會(huì)導(dǎo)致肝中的線粒體腫脹，無法適應(yīng)不同的營養(yǎng)條件，并伴隨呼吸減弱和氧化應(yīng)激升高，進(jìn)一步發(fā)展為脂肪肝與胰島素抵抗。生物鐘紊亂還會(huì)加劇乙醇介導(dǎo)的肝糖原代謝紊亂，同時(shí)也表明長期飲酒會(huì)擾動(dòng)肝生物鐘破壞糖原代謝各個(gè)方面的時(shí)間依賴性變化，加速脂肪肝的發(fā)展[42]。

3.5 晝夜節(jié)律紊亂對腸道的損傷及腸道菌群失調(diào)的影響

晝夜節(jié)律會(huì)導(dǎo)致多種消化系統(tǒng)疾病。研究發(fā)現(xiàn)損傷的腸道組織再生依賴于Bmal1，Bmal1可調(diào)控TNF-α和p21等的合成與表達(dá)，Bmal1缺失會(huì)導(dǎo)致腸道的持續(xù)惡化[43]。腸道菌群是寄居在人體腸道內(nèi)的微生物群，人體腸道內(nèi)寄生的細(xì)菌數(shù)目40萬億個(gè)，基因總數(shù)約為人自身基因數(shù)目的150倍。自主神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)胃腸道生物學(xué)過程，如免疫激活、腸道通透性、腸道微生物豐度等[44]。晝夜節(jié)律失調(diào)導(dǎo)致腸上皮屏障的破壞[45]。此外，腸上皮屏障完整性也受氧化應(yīng)激、飲食成分、腸道微生物群和微生物代謝物的影響。腸道中的酶活性和營養(yǎng)吸收能力會(huì)隨著晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而變化。Thaiss通過對小鼠進(jìn)行每3 d光照相移的改變，模擬人們經(jīng)歷8 h時(shí)差改變，同時(shí)每4 h采集糞便進(jìn)行16 s以及宏基因組學(xué)測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷光照位移小鼠糞便菌群的種類與豐富度發(fā)生顯著改變，隨后將糞便移植到無菌小鼠體內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量明顯增加，證明了節(jié)律紊亂通過微生物而影響機(jī)體代謝過程從而引起菌群的改變[16]。從結(jié)構(gòu)上看，黏液層密度的晝夜波動(dòng)也會(huì)影響與黏膜相關(guān)的微生物群落的組成，黏液層越靠近結(jié)腸末端越致密，其厚度有節(jié)律性波動(dòng)[46]。微生物群通過晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子NFIL3調(diào)節(jié)身體成分，NFIL3控制晝夜節(jié)律脂質(zhì)代謝程序性表達(dá)并調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞中的脂質(zhì)吸收和輸出，其晝夜節(jié)律振蕩的幅度由微生物群通過先天淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞生物鐘控制。對于特異性NFIL3敲除小鼠擾亂了腸道菌群對于脂質(zhì)攝取的調(diào)節(jié)和儲(chǔ)存，從而引起肥胖、糖尿病和心血管疾病等代謝疾病的發(fā)生[47]。

4 小結(jié)

事實(shí)上，機(jī)體的大多數(shù)代謝過程都受到晝夜振蕩的影響，現(xiàn)代社會(huì)許多外部環(huán)境的影響加劇了晝夜節(jié)律的紊亂，對人們的健康產(chǎn)生嚴(yán)重后果。通過構(gòu)建相關(guān)實(shí)驗(yàn)小鼠模型我們建立起了在生物鐘與代謝紊亂之間的分子聯(lián)系，在研究晝夜紊亂、疾病與腸道菌群相互影響的疾病機(jī)制研究中，可以結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)研究方法，找出與疾病相關(guān)的上下游機(jī)制，并找出影響代謝的靶細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，通過相應(yīng)抗生菌或益生菌的應(yīng)用來減輕慢性晝夜紊亂給機(jī)體帶來的影響。