MPTP 致帕金森病動物模型的研究進展*

呂海燕 侯廣玉 朱 梅

(牡丹江醫學院基礎醫學院，牡丹江 157011)

帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是常見于中老年人群的神經退行性疾病，患病率隨年齡增加逐步增高[1]，大約有1% 的 60歲以上的人受到 PD 的影響，80 歲以上人群患病率約為3%[2-3]，相關研究[4]數據顯示，我國 PD 患者高達1.7%，PD 其他相關疾病的發病率也隨著年齡的增長而增加。PD 主要病因是黑質-紋狀體內以多巴胺(dopamine, DA)合成減少，神經生化發生改變，多巴胺能神經元變性壞死會導致腦內多巴胺含量顯著減少。目前沒有有效方法治愈 PD 病變，為更好地研究其發病機制及臨床治療，制備實驗模型成為必不可少的研究手段。神經毒素在動物模型中誘導 PD 的特定臨床特征，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine,MPTP)、6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、百草枯和魚藤酮[5]。PD 模型各有優點和不足，不同造模方法、給藥方式及劑量都會影響實驗模型的作用機制與實驗結果。本文主要針對 MPTP 誘導的 PD 動物模型進行闡述。

1 帕金森病的動物模型

PD病理生理機制復雜，動物模型不能完全模擬出全部的病理和疾病癥狀。目前PD 動物模型主要為三類：神經毒素模型(如：MPTP、6-OHDA、魚藤酮、百草枯等)、轉基因模型(如：parkin、PINK1 和 DJ-1) 及以上二者聯用模型。PD模型在一定程度上再現了其主要病理生理特征，包括黑質致密部(substantia nigra compacta，SNc) DA能神經元進行性丟失、路易小體 (Lewy body，LB)形成和運動缺陷等[6]。6-OHDA模型可單雙側造模，但不能透過血-腦屏障，一般適用于藥理學篩選藥物。魚藤酮模型中毒素直接進入 DA 能神經元，高劑量造模會導致毒性作用大、副作用大、后遺癥多，主要用于研究 DA 能通路中的氧化應激和神經炎性反應[7]。百草枯模型符合環境因素誘發的 PD 研究，雖然PD模型行為學改變更顯著，但是模型制備成功率較低。遺傳基因動物模型的制備時間長、過程復雜、副作用多，從研究 PD的病理變化以及從基因分子水平為PD發病機制提供研究基礎。MPTP模型呈現 PD 急性或亞急性過程，可造成 DA 能神經元損傷或壞死而導致PD的部分臨床癥狀發生，經小劑量持續MPTP給藥制備的慢性動物模型不僅出現急性模型的PD病理改變，還能觀察到 α-突觸核蛋白的聚集，甚至有研究發現了LB 樣包涵體[8]。

2 MPTP的發現及毒性作用機制

MPTP是一種人工化學合成的中間產物，具有海洛因樣作用，美國國家心理健康研究所最早發現它的神經毒性和其他哌替啶衍生物[9]。1983 年美國加州少數披頭士服用了被 MPTP 污染的毒品后，出現了類似 PD 的臨床癥狀，繼而發展成為不可逆的亞急性帕金森綜合征[10]。

MPTP 作為一種鎮痛劑的脫羧雜質，是一種本身沒有毒性的脂溶性有機化合物，非常容易通過血-腦屏障。MPTP 選擇性地經星形膠質細胞線粒體外膜的單胺氧化酶-B (monoamine oxidase-B, MAO-B) 催化為中間代謝產物1-甲基-4苯基-2，3-二氫呲啶離子 (MP-DP+) ，然后該中間體再經過進一步自發氧化生成有毒代謝物 MPP+[11]。因化學結構與 DA 相似，MPP+可與多巴胺能轉運體 (dopamine transporter, DAT) 高度親和[12-13]。活性形式 MPP+通過 DAT 進入多巴胺能神經元后加速積聚，隨著濃度梯度積累，該物質能夠抑制線粒體復合物 I活性，干擾并阻斷線粒體電子傳遞鏈，最終導致 ATP 的消耗，氧自由基生成增加，細胞內一氧化氮 (NO) 含量增加，從而導致 DA 能神經元變性和死亡[14-16]。MPTP 動物模型因其在線粒體中具有獨特的拮抗活性而被推薦用于研究 PD 線粒體功能障礙。

3 MPTP 誘導的 PD 動物模型

PD 動物模型使用的動物種類廣泛多樣，可大致分為四類，包括嚙齒類、靈長類、哺乳動物(小型豬、狗、貓)和其他動物(果蠅、斑馬魚)。其中，嚙齒類動物最常用于神經毒素模型中細胞和分子水平上的機制研究[17]。用藥量和方法不同均對 MPTP 模型的造模結果有較大影響[18]，MPTP 可以通過腹膜內、皮下、靜脈內給藥，模擬其他肌肉注射的功能障礙以及產生雙側損傷的能力，雙側病變對于人類疾病影響在有限的適當區域特別有用[19-20]。在注射毒素后，行為測試中可以看到運動障礙，但在急性中不易察覺[21]。

3.1 MPTP 猴模型

在研究神經系統疾病的過程中，非人類靈長動物 (non-human primates NHP) 模型在對疾病機制方面研究起關鍵作用，因為 NHP 與人類的遺傳和生理密切相關[22]，人與猴基因組相似度95%，NHPs中的MPTP模型癥狀、病理生化指標及神經病理學方面的改變與人類 PD 臨床表現相似并且癥狀穩定，對 PD 治療藥物的反應也與人類相似[23]，廣泛用于測試抗 PD 藥物和潛在的疾病改善干預措施[24]，例如，獼猴的 SNc 中多巴胺能神經元顯著損失，并誘導出 PD 的主要軸向運動和姿勢的異常[25]，表現出類似人類舞蹈肌張力障礙的左旋多巴引起的運動障礙[6]。

MPTP 毒性作用存在種屬差異，不同給藥方式和給藥時間會表現出不同的病理特征。如食蟹猴和恒河猴同屬于獼猴，但是食蟹猴對 MPTP 的敏感性更強[26]。MPTP 暴露引起的神經毒性很快，不能模擬 PD 慢性發生的過程[26]。在此基礎上建立了一個穩定的慢性 NHP 帕金森模型[27]，一周兩次肌肉注射小劑量給藥(0.2 mg/kg)。采用慢性 MPTP 給藥方案[28](肌肉注射0.2～0.5 mg/kg，1 次/周，持續21 周)，模型中重現 PD 患者大腦中多巴胺能神經元退變過程。連續3 d對狨猴進行皮下注射給藥，第0、1和2天的劑量分別為2、2和1 mg/kg，MPTP總積累劑量為5 mg/kg，模型猴的左右兩側大腦損傷程度不一致，行為學特征持續了1年以上[29]。老年猴通常比青年猴更易感[30]，5～9 歲恒河猴所需要的MPTP 劑量是20～23 歲恒河猴的3倍[31]。有研究[32]發現老年恒河猴肌肉注射制備模型時模型猴病情變化不可控，采用肌注+靜脈注射給予 MPTP 的青年恒河猴呈現了穩定的運動和非運動癥狀[33]。

靈長類動物在 PD 研究中使用較早，MPTP 猴模型獲得了與 PD 神經退行性變、線粒體功能障礙和氧化應激相關的重要信息，但是非人靈長類動物模型優缺點明顯[34]。雖然該類動物與人類進化親緣性最高，實驗結果最為接近，但該類動物在每次實驗中使用數量較少，飼養、操作復雜，成本較高，且使用數量局限。

3.2 MPTP 鼠模型

受經濟、倫理道德等的原因限制，只有少數的實驗室能夠使用靈長類模型[35]，與靈長類動物相比較，嚙齒類動物價格更便宜、更易于控制，又因大鼠對 MPTP 毒性具有較強抵抗性[36]，所以 MPTP 小鼠模型成了最普遍應用的 PD 動物模型[37]，其中最敏感的小鼠系是C57BL/6 品系的小鼠，己被廣泛用于研究 PD 的發病機制、診斷和治療[38-41]。

根據不同的間隔時間、注射劑量、方式以及時間來建立不同研究目的的模型，主要有急性、亞急性和慢性模型。急性 MPTP 給藥主要引起 DA 能神經細胞非凋亡性死亡[42]，而長期施用低、中等劑量的神經毒素導致由凋亡性細胞死亡引起的進行性的神經變性，可以反映 PD 患者大腦中的細胞分子生物學變化[43]。MPTP 小鼠模型根據不同的研究目的其制備方式可以大致分為4種[44-45]：(1)前 PD 模型：一次小劑量 MPTP 腹腔注射(10～20 mg/kg) ，適用于代償機制研究；(2)急性 PD 模型：間斷 MPTP腹腔注射 (20 mg/kg) ，4 次/d，每2 h一次，連續1～2 d，大劑量時引起急性神經元變性壞死，常用于晚期 PD 的神經解剖、生化等研究；(3)亞急性 PD 模型：MPTP 腹腔注射 (20～30 mg/kg) ，1 次/d，連續5 d，神經損傷呈進行性加重，常研究反應較慢的代償機制，如受體表達等[46-47]；(4)慢性 PD 模型：MPTP 腹腔注射(4 mg/kg) ，1 次/d，連續20 d。模型小鼠在急性中毒期會有癥狀表現，如瞳孔散大、豎毛、唾液過多及陣攣性癲癇發作等癥狀，一般注射后的15～30 min出現，但是能夠很快恢復正常狀態。當然，也有的實驗沒有觀察到造模后小鼠的行為改變，原因可能與小鼠種屬、年齡、藥量或者 MPTP 敏感性的不同有關。所以，盡管模型小鼠有明顯的類似自主活動減少之類的運動障礙癥狀，但很少能見到長時間典型的 PD 運動障礙。

研究[44]發現，慢性模型中小鼠中腦黑質部冠狀切片的 TH 免疫組化染色更能表現出PD病理上的變化；通過觀察 HE 染色切片，慢性模型組神經細胞數量減少，細胞形態改變，核仁染色較淺甚至消失，慢性模型更符合 PD DA 神經元凋亡的特性；爬桿和懸掛實驗測試小鼠運動能力指標，慢性組比亞急性組小鼠爬桿時間更長，懸掛支撐時間也短，更能表現出 PD 在行為上的改變。綜上所述，MPTP 制備的慢性 PD 小鼠模型更有代表性，更有利于進行 PD 動物實驗研究。

4 結語

PD 動物模型中使用更多、應用范圍更廣的是神經毒性模型，此模型主要優勢在于操作簡單，成本較低，結果重復性較好。MPTP 模型在探討 PD 發病原因和發病機制方面具有很大潛力，MPTP 模型被證明能成功的用于測試新型神經保護策略逆轉或減緩疾病的進展。雖然研究者能夠通過動物模型從不同的作用機制、不同的角度，全方面地模擬 PD 的發生，但是動物模型所反映的病理變化與 PD 患者現實表現出的病理病變與臨床癥狀仍存在很大差異，因此，我們應更著眼于PD 動物模型的有效性與結果可重復性，不斷完善 PD 模型制備方法，利用新興科技技術盡早構建出可重復性高、成功率高、穩定且高度契合臨床PD患者的動物模型。