三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）foxl2基因功能初探及相關miRNA分析

張夢倩，張景琰，葛紅星，劉萍, ，李健, ，孟憲亮, 4*

( 1. 江蘇海洋大學 江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266237；4. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部水生動物基因組學重點實驗室，山東 青島 266071)

1 引言

foxl2（forkhead box protein L2）是Forkhead轉錄因子超家族的一員，是哺乳動物卵巢發育最早的標志性啟動基因[1]，也是第一個被認定在卵巢發育中發揮重要作用的常染色體基因[2]。2001年，Crisponi等[3]在對瞼裂狹小綜合征伴隨卵巢早衰患者致病基因的定位研究中，首次發現foxl2編碼基因與卵巢發育相關，研究結果顯示，所有被檢測的卵巢早衰患者的foxl2基因都發生了突變。通過觀察foxl2基因突變或缺失對小鼠卵巢的影響，進一步確認了foxl2基因在卵巢發育中的重要作用。通過基因敲除的方法，發現foxl2缺失的純合子（foxl2-/-）雌鼠的卵巢呈現小而不規則狀態，并且其中沒有初級卵泡的形成，卵巢發生退化，沒有生育能力[4-6]；foxl2的突變也會造成卵巢發育的異常，卵巢中的卵泡數量會減少，卵巢出現早衰[7]。在非哺乳類脊椎動物中，foxl2基因與卵巢發育的密切相關性也已被證實[8-11]。Shi等[12]研究了牙鲆foxl2基因的多態性與其卵巢發育之間的相關性，發現foxl2單一位點的突變可以造成牙鲆卵巢指數的變化。foxl2在脊椎動物卵巢發育中不可或缺的作用使其成為研究卵巢發育分子調控機制非常重要的候選基因[7,13]。

對脊椎動物中的研究發現，foxl2的表達受到microRNA（miRNA）的調控[14]。miRNA是一類平均長度為22 bp的內源性單鏈非編碼RNA，能夠與靶基因的3′非編碼區域（Untranslated Region, UTR）特異性結合，抑制翻譯或降解其mRNA，從轉錄后水平對靶基因表達進行負調控，在動物的生長、發育、生殖等過程中都發揮重要作用[15]。研究表明，miR-133b可以靶向調控小鼠foxl2的表達，進而調節其卵巢發育過程[16]。近些年，miRNA對卵巢發育的調控作用已成為甲殼動物生殖生物學研究的新熱點。研究表明，miR-9能夠通過調控ERK信號通路關鍵基因進而調節擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的卵巢發育[17]。此外，miRNA還參與了切除眼柄誘導三疣梭子蟹卵巢成熟的過程。

目前，在無脊椎動物中有關foxl2的研究剛剛起步，僅在海膽（Strongylocentrotus purpuratus）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、擬穴青蟹等少數物種中獲得了相應foxl2基因的cDNA序列。在對櫛孔扇貝的研究發現，干擾foxl2表達后，卵巢發育相關基因的表達顯著下調。而在擬穴青蟹中，敲降foxl2后，卵黃蛋白原基因（vtg）的表達顯著上調[18]。上述研究表明，該基因在貝類和甲殼類卵巢發育中均發揮作用，但其功能可能存在差異。鑒于其在卵巢發育中具有重要作用，開展foxl2表達調控研究可能會為研發生殖調控技術提供重要參考。然而，有關無脊椎動物foxl2表達調控的研究較為罕見。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隸屬于甲殼亞門（Crustacea），十足目（Decapoda），梭子蟹科（Portunidae），梭子蟹屬（Portunus），廣泛分布于中國、韓國、日本等河口和沿海水域，是我國重要的海水養殖種類。近些年，梭子蟹養殖產業發展迅速，2018年養殖產量已達11.38×104t[19]。然而，由于對三疣梭子蟹生殖調控的認知不足，未能建立起高效的生殖調控技術，高質量苗種的產量無法滿足需求，嚴重限制了養殖產業的可持續發展。因此，亟需深入開展三疣梭子蟹生殖調控機理研究。本研究克隆了三疣梭子蟹foxl2（Ptfoxl2）基因的cDNA全長序列；分析了其在不同組織、不同發育時期以及切除眼柄后的表達模式；研究了干擾該基因表達對vtg基因表達的影響；預測了靶向foxl2的miRNA，并在細胞水平進行了驗證；分析了miRNA在不同發育時期以及切除眼柄后的表達特征。研究結果有助于深入理解三疣梭子蟹生殖調控機制，為研發生殖調控新技術提供參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗所用三疣梭子蟹取自山東省昌邑市海豐水產養殖有限責任公司昌邑實驗基地。選取附肢完整且無明顯傷痕的雌性三疣梭子蟹，體重為52～261 g。在實驗室條件下暫養7 d。水溫為（20±2）℃、鹽度為31±1、pH為7.6±0.3，持續充氧。每天17:00投喂鮮活菲律賓蛤仔，8:00清除箱底排泄物及食物殘渣后更換1/3～1/2等溫度的新鮮海水。

2.2 Ptfoxl2 cDNA全長克隆

根據三疣梭子蟹性腺轉錄組數據中foxl2基因片段序列[20]，使用Primer 5.0軟件設計foxl23′和5′特異性引物（表1）。利用Trizol試劑提取三疣梭子蟹組織總RNA，采用Nanodrop微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量以及完整性。按照SMART RACE Amplification Kits說明書，利用cDNA 末端快速擴增（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）所需的cDNA模板，使用Advantage 2 PCR Kit進行3′和5′末端擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收試劑盒得到擴增的目的片段，用pMD18-T載體連接所得目的片段，并轉入DH5α感受態細胞中，涂板過夜培養，菌落檢測后進行測序分析。

表1 實驗所用引物的序列Table 1 The sequences of the primers used in this study

2.3 序列分析及系統進化分析

利用VecScreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去除載體序列，由Contig express軟件進行序 列 拼 接、ORFFinder（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/）進行開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）預測及氨基酸翻譯。利用ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）進行分子量及等電點的預測，利用Interpro Scan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）進行蛋白質功能結構域分析。使用Bioedit軟件對三疣梭子蟹foxl2氨基酸序列與從GenBank中下載的其他物種的foxl2氨基酸序列進行比對。

2.4 Ptfoxl2基因的表達分析

2020年9月至2021年1月，收集三疣梭子蟹卵巢發育不同時期的樣本。將梭子蟹在實驗室條件下暫養7 d。將樣本卵巢組織分為兩份，一份保存于液氮中，另一份采用4%多聚甲醛固定。參考吳旭干等[21]對卵巢組織分期方法，在顯微鏡下觀察三疣梭子蟹樣品的組織學特征，并將卵巢分為5個時期。

根據三疣梭子蟹foxl2序列設計特異性引物（表1），參照AG SYBR Green Pro Taq HS qPCR試劑盒說明書對三疣梭子蟹不同組織、不同發育時期foxl2基因相對表達量進行分析。反應體系（20 μL）：10 μL SYBR Green Pro Taq HS Premix II (2×)、0.4 μL ROX Reference Dye II、0.8 μL 10 μmol/L的 正 反 向 引 物、6.0 μL DEPC水和2.0 μL cDNA稀釋液。反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個循環。foxl2相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.5 切除眼柄實驗

實驗選用處于卵巢III-IV期三疣梭子蟹雌蟹為實驗動物，切除眼柄方法采用燒紅鑷子緊捏眼柄基部3 s。將切除雙側眼柄后的三疣梭子蟹養殖于室內循環水系統，為防止其打斗，每個10 L的養殖缸內僅放置1只梭子蟹。切除眼柄后1 d、3 d、6 d分別取3只三疣梭子蟹，解剖收集卵巢組織，樣品均在液氮中速凍，并保存于-80℃超低溫冰箱用于后續基因表達分析。

2.6 RNA干擾實驗

采用New England Biolabs公司的HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis試劑盒合成RNA干擾實驗（RNA interference，RNAi）所需的Ptfoxl2dsRNA，所用引物序列見表1。該實驗以處于卵巢快速發育期（III-IV期）的雌蟹（體重為（206.7±5.8）g）為實驗動物，以注射綠色熒光蛋白（GFP）dsRNA的個體為對照組，以注射Ptfoxl2dsRNA的個體為干擾組。GFP dsRNA和Ptfoxl2dsRNA的注射劑量均為2 μg/g體重，注射部位為第三步足基部。注射24 h和48 h后，對照組和干擾組分別取3個個體，解剖收集卵巢組織，液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱用于后續基因表達分析。

2.7 Ptfoxl2相關miRNA預測和驗證

通過miRanda和RNAhybrid軟件預測潛在靶向Ptfoxl23′UTR區域的miRNA。通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗，對預測miRNA對Ptfoxl2的調控作用進行驗證。將miRNA類似物和陰性對照類似物（由通用生物股份有限公司合成），與包含有野生型和突變型miRNA結合位點3′UTR序列的pmirGLO質粒，分別共轉染到293T細胞中。轉染48 h后，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性相對值。

2.8 Ptfoxl2相關miRNA的表達分析

利用miRcute miRNA提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）提取三疣梭子蟹不同組織、不同發育時期及切除眼柄后卵巢組織的miRNA，使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）進行反轉錄，采用miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）檢測miRNA在三疣梭子蟹不同組織、不同時期以及切除眼柄后的相對表達量。反應體系（20 μL）：10 μL 2×miRcute Plus miRNA PreMix、0.4 μL正 反 向引物、2.0 μL miRNA第一鏈 cDNA、7.2 μL ddH2O。反應程序：95℃ 15 s；95℃ 20 s、60℃ 34 s，40個循環。反應完成后相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2.9 統計學分析

采用SPSS19.0軟件進行數據統計分析。兩組之間比較應用獨立樣本t檢驗，多組之間比較應用單因素方差分析。以p＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 Ptfoxl2基因cDNA全長序列分析和系統進化分析

序列分析表明，Ptfoxl2基因cDNA全長2 502 bp（OK413951），3′端和5′端基因片段長度分別為211 bp和701 bp，包含1 590 bp的開放閱讀框，共編碼529個氨基酸（圖1）。在線分析發現，Ptfoxl2基因包含1個Forkhead結構域（228～323 aa）。通過BLAST同源性比對分析，發現三疣梭子蟹Ptfoxl2氨基酸序列與擬穴青蟹Ptfoxl2的同源性最高，為96%；與中華絨螯蟹、斑節對蝦（Penaeus monodon）的同源性分別為86%、85%，且都含有Forkhead結構域（圖2）。

圖1 Ptfoxl2基因cDNA全長序列以及推導的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Ptfoxl2 gene

圖2 4種甲殼動物foxl2氨基酸序列多重比對Fig. 2 Multiple alignments of the amino acid sequences of foxl2 in four crustacean species

3.2 Ptfoxl2基因表達分析結果

利用Real-time PCR技術，分析了foxl2基因在三疣梭子蟹不同組織的表達分布特征。結果顯示，Ptfoxl2在所有被測組織中均有表達，其在卵巢組織中的表達量最高（p＜0.05），其次為腦神經節、肝胰腺、胃、胸神經節等組織，在血淋巴中的表達量最低（圖3A）。通過對Ptfoxl2在卵巢發育不同時期的表達分析發現，該基因在不同時期的表達存在顯著差異（p＜0.05），其在V期卵巢組織表達量最高，其次為III期、IV期，在II期卵巢中表達量最低（圖3B）。切除眼柄后Ptfoxl2表達分析結果表明，切除眼柄后第1天、第3天、第6天，該基因在卵巢組織的表達量均顯著下降（p＜0.05）（圖3C）。

圖3 Ptfoxl2基因在三疣梭子蟹不同組織（A）、不同卵巢發育時期（B）以及切除眼柄后（C）的表達Fig. 3 The expression of Ptfoxl2 in different tissues (A), in different ovarian developmental stages (B) and after eyestalk ablation (C)

3.3 Ptfoxl2干擾實驗結果

與注射GFP dsRNA組三疣梭子蟹相比，注射Ptfoxl2dsRNA的個體在24 h和48 h后，卵巢Ptfoxl2的表達均出現了顯著下調（p＜0.05）（圖4A），干擾效率分別為60.24%和53.15%。qRT-PCR結果顯示，注射Ptfoxl2dsRNA組vtg基因的表達顯著上調（p＜0.05）（圖4B）。

圖4 注射Ptfoxl2 dsRNA 和GFP dsRNA后卵巢Ptfoxl2（A）和vtg（B）基因的表達Fig. 4 Relative expression of Ptfoxl2 (A) and vtg (B) in ovary after injecting Ptfoxl2 dsRNA and GFP dsRNA

3.4 Ptfoxl2相關miRNA的預測和雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證

生物信息學預測結果顯示，miR-9以及本實驗在前期研究中新識別到的2個miRNA—novel-52和novel-68可能與Ptfoxl23′UTR結合。通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗，對miRNA與Ptfoxl2靶向調控作用進行了驗證（圖5）。結果顯示，共轉染novel-52類似物和pmirGLO-Ptfoxl2-3′UTR組以及共轉染novel-68類似物和pmirGLO-Ptfoxl2-3′UTR組螢火蟲相對熒光素酶活性未出現顯著變化（p＞0.05），而共轉染miR-9類似物和pmirGLO-Ptfoxl2-3′UTR組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性比值顯著降低（p＜0.05），表明miR-9能夠與Ptfoxl2基因3′UTR靶向結合。

圖5 共轉染野生型和突變型質粒和miRNA類似物后熒光素酶的相對活性Fig. 5 Luciferase activity of the reporter plasmid containing wild-type or mutant target site after co-transfection of plasmid and miRNA mimics

3.5 Ptfoxl2相關miRNA的表達分析結果

組織表達分布結果顯示，miR-9在三疣梭子蟹各組織中均有表達，其在鰓、卵巢和胃中的表達量顯著高于其他組織（p＜0.05），其次為肌肉、胸神經節，腦神經節中的表達量最低（圖6A）。miR-9在不同發育時期卵巢組織中的表達量存在顯著差異（p＜0.05），隨著卵巢發育其表達量先上升后下降，在IV期達到最高，在V期表達量出現顯著降低（圖6B）。切除眼柄后，卵巢組織中miR-9的表達量出現顯著變化（p＜0.05），在第1天表達量出現顯著上調，在第3天達到最高值，在第6天開始降低（圖6C）。

圖6 miR-9在三疣梭子蟹不同組織（A）、不同卵巢發育時期（B）以及切除眼柄后（C）的表達Fig. 6 The expression of miR-9 in different tissues (A), in different ovarian developmental stages (B) and after eyestalk ablation (C)

4 討論

本研究克隆了三疣梭子蟹foxl2基因cDNA全長序列，預測氨基酸序列包含1個高度保守的Forkhead結構域和1個核定位信號序列。同源性分析顯示，Ptfoxl2與其他蟹類foxl2序列具有較高的同源性，其中與擬穴青蟹同源性高達96%，提示Ptfoxl2可能與擬穴青蟹foxl2（Spfoxl2）功能具有相似性。但是，Ptfoxl2與Spfoxl2組織表達分布存在差異[18]。雖然Ptfoxl2與Spfoxl2都在卵巢組織中高表達，但Ptfoxl2在所檢測的組織中均有表達，而Spfoxl2僅在卵巢、精巢和肝胰腺中表達，表明Ptfoxl2的功能可能具有多效性。

大量研究發現，foxl2在脊椎動物卵巢顆粒細胞分化、卵巢發育和功能維持等方面具有重要作用。目前，foxl2基因序列已在數種無脊椎動物中克隆獲得，但針對其功能的研究卻鮮有報道。Liu等[22]發現，foxl2在櫛孔扇貝中的表達呈明顯的性別二態性，在卵巢中的表達遠高于精巢，推測該基因在卵巢發育中發揮作用。Wei等[23]發現，海灣扇貝幼貝中foxl2的表達與雌激素的水平呈正相關，推測該基因通過調控雌激素水平，進而調節性腺分化過程。在對中華絨螯蟹的研究發現，foxl2在卵巢成熟期表達量顯著上調，與DDX20和FTZ-F1結合，抑制卵巢中vtg基因的表達。在不同組織中的表達分析結果顯示，Ptfoxl2在卵巢組織中的表達量最高，顯著高于其他組織，暗示其可能參與了三疣梭子蟹卵巢發育調控過程。該基因在卵巢發育過程中的表達模式與中華絨螯蟹相似，同樣在卵巢近成熟期和成熟期表達量顯著升高。該時期卵黃發生以外源性卵黃合成為主，即在肝胰腺內合成，通過血淋巴轉運到卵巢組織，而卵巢內的卵黃合成減少。此外，干擾Ptfoxl2表達后，卵巢組織vtg基因的表達顯著上調，這與擬穴青蟹foxl2干擾實驗結果一致[18]。上述結果表明，foxl2可能在三疣梭子蟹卵巢發育中發揮重要作用，能夠顯著抑制內源性卵黃合成。

迄今，關于甲殼動物foxl2表達調控的研究還未見報道。切除眼柄是生產中常用的刺激甲殼類性腺成熟的方法，此方法通常認為是通過去除眼柄中X-器官竇腺復合體分泌的性腺抑制激素（GIH）來刺激性腺成熟，但是切除眼柄會損傷親體，且會造成卵質量下降、孵化率降低等問題[24]。近些年，為了探尋替代眼柄切除的促熟新方法，國內外研究者針對切除眼柄誘導性腺發育的分子機制開展了較為深入的研究。已有研究表明，切除眼柄誘導卵巢成熟是一個涉及多種分子和信號通路的復雜過程。Uawisetwathana等[25]發現，切除斑節對蝦眼柄能夠激活性腺激素釋放激素信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟等信號通路。本實驗室前期研究發現，切除眼柄后，三疣梭子蟹Cdk7、Cyclin H等基因表達均出現顯著上調，表明切除眼柄能夠激活成熟促進因子（Maturation-Promoting Factor，MPF），從而促進卵母細胞成熟分裂[26-27]。此外，切除眼柄會促進三疣梭子蟹甲基法尼酯合成相關蛋白的表達，激活鈣離子信號通路[28]。本研究中，三疣梭子蟹卵巢foxl2基因的表達在切除眼柄后第1天、第3天、第6天均出現了顯著下調。因此，我們推測Ptfoxl2受眼柄神經內分泌因子的調控，參與了切除眼柄誘導卵巢成熟的過程。切除眼柄能夠抑制foxl2的表達，進而促進卵黃合成。

近些年，miRNA已被證實在甲殼動物卵巢發育中發揮重要作用。Song等[29]發現，miR-2和miR-133通過調控Cyclin B的表達，控制中華絨螯蟹卵母細胞成熟過程。Jia等[30]對擬穴青蟹的研究表明，miR-277參與眼柄中卵巢發育相關重要神經肽—卵黃抑制激素的表達調控。目前，miRNA是否參與了甲殼動物foxl2基因的表達調控仍未知。本研究利用生物信息學方法預測了其靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗，從細胞水平進行了驗證。結果顯示，miR-9能夠與Ptfoxl23′UTR靶向結合。分析顯示，miR-9在鰓、肝胰腺組織和胃中表達量較高，但在這3個組織間無顯著差異，表明miR-9可能具有多種功能。同一miRNA可能調控多個靶基因，其在不同組織中可能也發揮不同的作用[31]。在卵巢V期（成熟期），miR-9表達量顯著下調，而Ptfoxl2表達則顯著上調。此外，切除眼柄后，卵巢miR-9的表達顯著出現上調，而Ptfoxl2表達趨勢與之相反，進一步表明，miR-9能夠從轉錄后水平調控Ptfoxl2的表達。

5 結論

本研究克隆得到Ptfoxl2基因cDNA全長序列，分析了該基因在不同組織、不同發育時期卵巢組織以及切除眼柄后的表達模式，研究了干擾其表達對卵巢組織vtg基因表達的影響，初步證實Ptfoxl2參與三疣梭子蟹卵巢發育調控，能夠抑制內源性卵黃合成。預測了靶向Ptfoxl2的miRNA，并在細胞水平進行了驗證。結合miR-9在卵巢發育不同時期以及切除眼柄后的表達分析，首次證實miRNA（miR-9）能夠從轉錄后水平調控Ptfoxl2的表達。研究結果為深入開展三疣梭子蟹卵巢發育調控機制，研發生殖調控新技術提供了重要參考。