印度洋深海沉積物樣品純培養細菌的分離鑒定

姜釗 ，張衛花 *

( 1. 西藏民族大學 藏藥檢測技術教育部工程研究中心，陜西 咸陽 712082；2. 西藏民族大學 西藏高原相關疾病分子遺傳機制與干預研究省級重點實驗室，陜西 咸陽 712082)

1 引言

海洋環境復雜多樣，理化性質獨特，孕育了豐富的海洋微生物，從海洋表層到海底幾千米的地方都有其生命活動。海洋微生物不僅能進行光合作用，也能通過同化海洋環境中的各種營養物質為大型生物提供營養；同時，也能以分解者的角色為海洋植物提供無機營養，維持整個海洋生態系統的良性可持續的循環[1]。然而，隨著海洋資源的過渡開采，人類正面臨著諸如資源短缺、環境污染和人類健康危機等日益嚴重的生存與發展危機。在這種大背景下，海洋微生物的重要性不僅僅體現在元素循環、物質轉化和能量流動方面，也在生物的演化研究、CO2的減排、節能以及資源的可持續發展與利用等方面發揮積極作用[2]。

2010年由麥切·索基恩負責的全球海洋生物普查計劃順利完成，該計劃分析了超過1 200個區域的海洋樣本，最終估計海洋微生物種類達到10億種左右，微生物的總重量相當于2 400億頭非洲象，這些微生物無論是從多樣性還是豐富度方面都達到了令人吃驚的程度[3]。但是，海洋微生物的純培養數量依然較少，科學家們開展了包括太平洋、印度洋、南海、Woodlark海盆、日本海、秘魯邊緣、卡斯卡底古陸邊緣海域、鄂霍次克海、地中海等一系列海洋環境微生物的純培養及多樣性分析工作[4-11]，統計發現，被描述的海洋來源微生物物種只占全球全部已描述微生物的9.7%，每年增加速率僅為0.93%，大多數海洋微生物還沒有實現試驗室的純培養[12]。環境樣品中可培養微生物的多樣性及出菌率與菌種分離時所用的樣品預處理方法、選擇培養基的種類以及培養條件等息息相關。比如，樣品稀釋法可減少優勢微生物的競爭，利于寡營養微生物的分離[13]；稀有碳氮源的添加，可獲得更多稀有放線菌和細菌類群[14]；新鮮濕樣經過自然風干稀釋后，進行瞬時濕熱處理，適合放線菌類群的分離培養[15-16]。因此，不同分離方法的探索、培養基的設計，在海洋微生物純培養分離中顯得格外重要。

為調查印度洋深海沉積物放線菌資源的豐富性，同時探索放線菌分離條件，本研究以采自印度洋深海沉積物樣品為研究對象，利用多種分離培養基，采用濕熱處理法，在前期響應面法優化的樣品處理條件基礎上，對采自印度洋深海沉積物樣品中放線菌進行純培養分離，爭取最大程度分離得到純培養放線菌及其他類群，以期為后期放線菌代謝產物分離及相關研究提供材料。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品來源

本實驗樣品于2013年采自印度洋，為深海沉積物樣品，采用抓斗、箱式取樣方法獲得，沉積表層約5 cm深度作為取樣區域，共取樣12份，-20℃保存，取樣點的經緯度及深度信息見表1，圖1。

圖1 取樣點地理分布Fig. 1 The geographical distribution of sampling sites

表1 印度洋沉積物采樣點信息Table 1 Information of sampling sites from Indian Ocean sediment

2.1.2 分離培養基

依照預實驗結果，選取14種分離培養基（表2）進行培養分離，每種培養基添加2.12%海鹽（海彩海水晶，上海海彩生物科技有限公司）以模擬海水環境，同時添加50 mg/L制霉菌素和25 mg/L萘啶酮酸，以抑制真菌和革蘭氏陰性菌的生長，從而獲得更多放線菌類群。

表2 14種分離培養基Table 2 14 kinds of culture media

2.2 菌株分離、純化及保藏

為獲得更多海洋放線菌類群，根據前期優化獲得樣品的最優處理條件，采用濕熱處理方法進行分離：（1）沉積物樣品于無菌培養皿風干1.7 d；（2）稱取2 g樣品至18 mL無菌水中混勻，水浴鍋濕熱處理（濕熱處理溫度為55℃，濕熱處理時間為1.3 min）；（3）置于28℃搖床搖勻20 min，分別取100 μL樣品稀釋液涂布于14種分離培養基（均加2.12%海鹽，同時添加50 mg/L制霉菌素和25 mg/L萘啶酮酸），每組3個重復，并置于28℃恒溫培養箱培養30 d；（4）挑取每個平板不同形態菌落于TSA及IPS2培養基中劃線、純化、編號，記錄分離來源及分離培養基信息；（5）純化培養后收集每株菌菌體并利用牛奶管保藏。

2.3 16S rRNA基因擴增及測序

利用酶解法提取收集的各菌株DNA[17]，采用細菌16S rRNA基因的通用引物[18]進行PCR擴增（PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′； PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴增體系：10×Buffer（Mg2+2.5 mmol）5 μL、正向引物 PA（0.25 μmol）1 μL、反向引物 PB（0.25 μmol）1 μL、dNTP 1 μL、DNA 1 μL、Taq DNA聚合酶0.3 U，用ddH2O定容至50 μL。PCR擴增反應條件：95℃預變性4 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min（循環30次）；72℃延伸10 min。PCR產物用0.8 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用λ-EcoT14 Idigest DNA Marker為對照，產物檢測回收后送昆明泊尚生物有限公司進行測序，先測一個反應1～800 bp（V1-V4）判斷種屬相似性，若低于98.5 %再進行反向測序。

2.4 基于16S rRNA基因的系統發育分析

通過觀察返回的16S rRNA基因序列峰圖，選取測序結果好的序列，雙向測序則利用Seqman進行拼接，得到1 500 bp左右全長序列。利用EzBioCloud BLAST（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）[19]進行序列相似性分析；選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，采用Clustal X軟件[20]進行多序列比對，比對結果利用MEGA 7.0[21]軟件分析，基于鄰近法（NJ）[22]進行系統發育樹的構建。

3 結果與討論

3.1 菌株的分離結果

分離平板培養30 d后，根據菌落大小、形態、顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進行純化、去重，總共從12個分離樣品中純化得到343株放線菌和細菌純培養物，并對其16S rRNA基因進行了測序。測序結果經EzBioCloud數據庫比對分析，鑒定為4個門：放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；分屬5個綱：放線菌綱（Actinobacteria）、噬纖 維 菌 綱（Cytophagia）、芽 孢 桿 菌 綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；13個目：棒桿菌目（Corynebacteriales）、微球菌目（Micrococcales）、丙酸桿菌亞目（Propionibacteriales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、鏈霉菌目（Streptomycetales）、鏈孢囊菌目（Streptosporangiales）、嗜纖維菌目（Cytophagales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、紅 細 菌 目（Rhodobacterales）、假 單 胞 菌 目（Pseudomonadales）和海洋螺菌目（Oceanospirillales）下的26個科39個屬121個種，如表3所示。可以看出：分離菌株中放線菌門占比最高，占13個科，20個屬，71個種（占比58.7%），這可能是因為樣品處理和培養條件更利于放線菌的選擇性培養；其次為變形菌門和厚壁菌門（分離種數分別占21.5%和17.4%）；擬桿菌門最少。各屬中分布的菌種數見表4，其中鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、考克氏菌屬（Kocuria）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、迪茨氏菌屬（Dietzia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、微桿菌屬（Microbacterium）、節細菌屬（Arthrobacter）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）為所采印度洋深海沉積物樣品中的優勢微生物類群，其中鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬分布最多。同時分離得到了部分數量較少類群，如：食烷菌屬（Alcanivorax）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、葉桿菌屬（Phyllobacterium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）、紫桿菌屬（Porphyrobacter）、芽球菌屬（Blastococcus）、劉志恒菌屬（Zhihengliuella）、檸檬球菌屬（Citricoccus）、拉氏桿菌屬（Rathayibacter）、威廉姆斯菌屬（Williamsia）等。將分離到的放線菌、細菌及近緣物種建立系統發育樹，見圖2和圖3。

圖2 印度洋沉積物中放線菌16S rRNA基因序列鄰近系統進化樹Fig. 2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of actinobacterial isolates collected from the Indian Ocean sediment

圖3 印度洋沉積物中細菌16S rRNA基因序列鄰近系統進化樹Fig. 3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of bacterial isolates collected from the Indian Ocean sediment

表3 分離菌株整體分布表Table 3 Overall distribution of isolated strains

表4 種分布百分比Table 4 Percentages of species distribution

3.2 不同樣點的菌株分離比較

統計各樣點菌株分離結果見圖4，由圖可知HF06、HF13、HF14、HF16、HF17、HF18、HF19采樣點樣品的多樣性較豐富，這7個采樣點都分離出了大于11個屬，18個種的菌株。其中HF17采樣點樣品的多樣性最豐富，可能因為樣品的分離及處理條件更利于其樣品純培養菌株的分離。鏈霉菌屬、微桿菌屬在這12個樣品中都分離到，為海洋沉積物微生物優勢類群。部分菌株只在極少數樣品中分離得到，例如：拉氏桿菌屬只在HF02采樣點樣品中分離得到；威廉姆斯菌屬只在HF06采樣點樣品中分離得到；地中海菌屬（Martelella）、葉桿菌屬只在HF10采樣點樣品中分離到；短桿菌屬（Brevibacterium）只在HF13采樣點樣品中分離到；嗜冷桿菌屬只在HF14采樣點樣品中分離得到；劉志恒菌屬只在HF17采樣點樣品中分離得到；芽球菌屬、類諾卡氏菌屬只在HF19采樣點樣品中分離得到；食烷菌屬只在HF10采樣點和HF19采樣點樣品中分離得到；兩面神菌屬（Janibac-ter）、鞘脂單胞菌屬只在HF02采樣點和HF17采樣點樣品中分離到；中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）只在HF10采樣點和HF17采樣點樣品中分離得到，不同采樣點中細菌分離多樣性差異明顯。

圖4 所有沉積物樣品中不同類群細菌菌株數目Fig. 4 Strain numbers of different bacteria groups isolated from all sediment samples

3.3 菌株的多樣性與分離培養基的關系

在分離的所有菌株中，由于對不同培養基的營養需求不同，每種培養基分離出的菌株數量不同，統計各培養基分離菌株數目見圖5。由圖可知，在14種分離培養基中，M2、M3、M7、M9、M10、M12、M13這7種培養基分離效果較好，分離菌株數都在15個種以上，M7培養基分離的菌株數超過20個種，M12超過30個種。顯而易見，培養基M7和M12分離的菌株多樣性最豐富，因此，包含不同營養物的培養基設計對菌株的分離極為重要。

圖5 不同培養基中分離的細菌菌株類群及數目Fig. 5 Strain numbers of different bacteria groups isolated from different culture media

3.4 潛在的新分類單元

目前普遍認為16S rRNA 基因序列相似性小于95%，且在系統進化樹上形成的穩定獨立分支又具有特征性堿基，可以大體作為屬的界限；16S rRNA基因序列相似性小于98%且DNA雜交同源性小于70%為“種”的界限[23-24]。因此，將16S rRNA序列相似性低于98%的菌株確定為潛在新分類單元，本研究共發現12個潛在分類單元（表5）。主要分布在食烷菌屬、節細菌屬、成對桿菌屬（Dyadobacter）、芽殖桿菌屬（Gemmobacter）、球菌屬（Macrococcus）、中慢生根瘤菌屬、葉桿菌屬、動性球菌屬（Planococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）9個屬。其中，菌株YIM M12122、YIM M12139和YIM M12140與最相近的菌株16S rRNA基因相似性均低于95%，是潛在的新屬。由此可見，印度洋深海沉積物中存在著大量的未被發現的微生物類群，是巨大的資源寶庫。

表5 潛在新物種的16S rRNA基因序列比對結果Table 5 Comparison of 16S rRNA gene sequences of potential new species

4 結論

采自印度洋的12個樣點中共分離得到343株放線菌和細菌純培養物，共分布在39個屬121個種。其中，放線菌門占58.7%，變形菌門占21.5%，厚壁菌門占17.4%，擬桿菌門占2.4%。對比以往海洋微生物分離結果（圖6）：Goodfellow和Fiedler[25]的研究統計發現，在海洋環境中發現的放線菌共有49個屬，包括12個新屬，這12個新的分類單元全部是2000年后才從海洋環境中首次發現和描述的；徐盈[26]從南海沉積物環境中分離得到40個科64個屬，其中18個屬與Goodfellow和Fiedler分離相同。在本研究中分離得到的39個屬中分別有12個屬和19個屬與文獻[25-26]分離的細菌屬相同，共有8個屬在3次分離中均得到，而本研究中檸檬球菌屬等16個屬在以上研究中并未分離得到。其中，人們很容易從海洋分離得到的優勢類群如小單胞菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬及迪茨氏菌屬[27]的后3個在本研究中大量分離得到，為本次分離得到的優勢類群。而專屬海洋菌鹽細菌屬（Salinibacterium）和鹽水孢菌屬（Salinispora）[14]未被分離到，說明了在純培養條件的局限下得到的微生物種類仍然有限。在本次分離中，得到部分數量較少的類群，如食烷菌屬、嗜冷桿菌屬、葉桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、紫桿菌屬、芽球菌屬、劉志恒菌屬、檸檬球菌屬、拉氏桿菌屬、威廉姆斯菌屬等，可能設計的培養基和樣品處理條件不利于上述類群的生長。不同的培養基分離差異比較中發現，不同培養基分離得到的物種數差異較大，也證明了不同的針對性培養基的設計及樣品處理方法的探索是得到更多可培養細菌的前提和保障。本研究共發現12個潛在分類單元，其中菌株YIM M12122、YIM M12139和YIM M12140與最相近的菌株16S rRNA基因相似性均低于95%，是潛在的新屬。研究表明，不同的培養方法和培養基的選擇直接影響到樣品中純培養微生物獲得的幾率和數量，后期可利用免培養的測序數據討論樣品所含微生物的多樣性，并結合其他分子生物學手段更好地設計和改造純培養方法及培養基，以加大純培養微生物的獲得率。