全局轉錄機器工程調控微生物代謝的應用進展

田鑫,戴健欣,田園,王光強,艾連中,熊智強

(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海食品微生物工程研究中心,上海,200093)

微生物精細調節自身轉錄翻譯和復雜代謝網絡,而在全局水平擾動其轉錄調控,可有效引起多基因協同調控效應。σ因子和全局轉錄因子作為微生物改造中極其重要的工程靶標,與多個協同因子共同維持細胞碳氮代謝和抗逆性等生理功能,突變后將顯著影響下游眾多基因的表達。因此,全局轉錄機器工程(global transcription machinery engineering,gTME)通過對全局轉錄因子改造,建立轉錄因子基因突變文庫,精準篩選以獲得滿足需要的超能細胞株,有效提高細胞代謝活力[1]。但高效特異性進化手段與靈敏快速的高通量方法是gTME主要限制環節。本文主要從gTME分子機制和應用方向展開綜述,介紹與gTME相配合的改造技術和篩選策略,以期為微生物代謝改造提供參考。

1 gTME作用機制

原核生物RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)由α2ββ’ω核心酶和σ亞基構成,σ亞基識別啟動子-35和-10區開啟轉錄,負責所有基因轉錄起始延伸和終止。gTME通過改造σ亞基引起大量調控基因轉錄水平波動,進而全局水平上影響細胞蛋白表達[2]。其中σ70家族指導參與應激反應和細胞生長的基因轉錄,RpoD、RpoS、RpoE、RpoN、RpoH、RpoF和FecI等σ70因子協同全局轉錄因子(如CRP、ArcAB、H-NS、FNR、FIS、LRP和IHF)構成gTME主調控網絡,有激活和抑制轉錄的雙重調節作用[3](圖1)。RpoD和RpoS調節1 000多個基因,具有控制轉錄開關、協同調控多個分類功能轉錄因子的能力,結合gTME改良細胞生長和穩定期壓力等表型[4]。CRP、ArcAB和H-NS分別負責不同功能群基因表達,參與穩定期生長和應答反應的基因轉錄。CRP調控分解代謝,由環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)形成復合體激活啟動子區域間蛋白質-蛋白質和蛋白質-DNA之間相互作用,影響95%受體蛋白表達,被廣泛用于gTME改良微生物滲透壓和氧化應激等方面。BASAK等[5]采用gTME改造大腸桿菌CRP,通過2.0 mmol/L H2O2富集篩選得出高耐受菌株OM3,相比野生型(不生長)生長速率提高到0.6/h,氧化耐受性提高36.84%。提高機理是CRP突變體與啟動子結合作用發生變化,使其轉錄水平增加8.9倍,同時RpoS和OxyR(氧化還原敏感調節因子)轉錄水平提高至7.76倍和3.48倍,共同加強OM3菌株氧化應激能力。H-NS是一種15.5 kDa的類核相關蛋白,生成的Hha-H-NS復合物調節操縱子特定序列和162個基因。GAO等[6]采用過表達和敲除建立大腸桿菌H-NS與耐酸性相關性,再利用gTME改造H-NS,耐酸性提高100倍。其中谷氨酸和谷氨酰胺依賴的耐酸系統中ybaS、ybaT和gadA顯著上調,證實H-NS可激活和調控多個耐酸系統提高耐酸性。ArcAB調節厭氧呼吸蛋白,控制氧化還原相關基因表達。CABEZAS等[7]依靠gTME改造ArcA,得到突變株Arc-D54,相比野生菌株在NaClO氧化應激下耐受性提高7倍,使ArcA下游基因(acrB,tdcB,fadB和cyoE)激活,但arcA敲除菌株不生長,表明ArcA顯著提高沙門氏菌抵抗NaClO氧化應激的能力。

圖1 RNA聚合酶與主調控網絡(全局轉錄因子和sigma因子)Fig.1 RNA polymerase and master regulatory network(global transcription factor and sigma factor)注:圓大小與調控基因數量相關,箭頭反應表達方向

真核生物中Spt蛋白是轉錄起始輔助因子Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉移酶復合體(Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase，SAGA)的組成部分，調節染色質TATA結合蛋白(TATA binding protein，TBP)啟動子結合,與RNA聚合酶Ⅱ及十幾種轉錄因子完成基因組mRNA轉錄。Spt15是TFIID(轉錄起始因子)的亞基,是RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的組成成分,結合TBP激活轉錄。通過gTME構建Spt15文庫操縱酵母TFIID組分引起轉錄子多基因重排,使RNAⅡ轉錄譜偏好變化,得到一株實現葡萄糖和木糖共發酵的釀酒酵母,木糖利用率達98.9%,而出發菌株不能利用木糖,此研究豐富了gTME在真核細胞中適用性[8]。人工轉錄因子(artifical transcription factor,ATF)通常由一種轉錄調控因子DNA結合域和另一種轉錄調控因子效應域融合形成的調控蛋白。gTME采用隨機組裝不同類型的鋅指蛋白(zinc finger proteins,ZFs)與CRP效應域構建ATF文庫,展現高度特異性和特征性,篩選得到的大腸桿菌MG1655突變株耐熱性增加并可耐受1.5%丁醇。總之,σ因子、全局轉錄因子和人工轉錄因子都在gTME中展現出強序列特異性和作用效果[9]。

2 gTME在應變工程中的應用

提高微生物抗逆性是gTME的重要應用,轉錄因子促進或抑制RNAP,差異化調節編碼蛋白質表達,在應變過程能顯著提高抵抗有機溶劑、高糖、高溫和強滲透壓等極端環境(表1)的能力。以大腸桿菌為例,RpoD和RpoS分別調控細胞對數期和穩定期與壓力響應相關基因的轉錄,全局轉錄因子CRP通過調節RpoS表達,間接調控細胞應激能力。ALPER等[10]采用gTME對大腸桿菌RpoD進行三輪突變,分離出突變株對乙醇有強耐受性,在70 g/L乙醇中能保持6 h倍增時間(對照不生長)。rpoD突變造成groEL和htpG等乙醇脅迫相關基因顯著上調。CHONG等[11]揭示全局轉錄因子CRP對提高大腸桿菌乙酸和甲苯耐受性有顯著功效,采取gTME獲得最優菌株A2的CRP氨基酸序列第138位點天冬氨酸替換成酪氨酸,影響CRP的DNA結合親和力,A2乙酸耐受性提高5倍,微陣列分析耐酸相關基因yfid、pflb和gadA表達水平上升,從而抑制細胞內酸化。另外,利用gTME構建CRP突變文庫調控有機溶劑耐受性,得到的大腸桿菌在0.23%甲苯中比生長速度達到0.51/h(對照無生長),對突變株測序分析CRP第136位苯丙氨酸替換為異亮氨酸導致β發夾結構改變,影響CRP調控基因轉錄水平,導致耐有機溶劑相關基因arcAB和rpoS轉錄水平提高,促進甲苯排出細胞[12]。

相比細胞展示技術、單基因敲除等傳統方法,gTME提高酵母抗逆性的優勢在于無需將融合蛋白定位宿主表面,改造表型廣泛且效率更高[13]。gTME誘導真核細胞強化抗逆性方法主要包括：(1)構建Spt或Taf突變庫,Spt亞基和Taf蛋白與編碼乙醇脫氫酶Ⅱ復合物功能相關。ALPER等[14]構建Spt15和Taf25的gTME文庫改良釀酒酵母乙醇耐受性和產量,篩選出突變株spt15p-100可耐受20%乙醇,乙醇產率增加到2 g/(L·h),而對照組僅為1.2 g/(L·h)。突變株在轉錄水平上數百基因差異表達,對高表達的12個基因進行單獨過表達和敲除,均未能達到gTME作用效果,表明細胞耐受性提高為多基因共同調控的結果。(2)通過下游基因結構性刺激提高有機溶劑耐受性。如酵母中Pdr1p(多藥耐藥轉運蛋白基因)不參與有機溶劑脅迫的反應,但由gTME修飾Pdr1p,使其在821位點由絲氨酸突變為精氨酸,下游編碼ABC轉運蛋白基因pdr10、pdr15、snq2和yor1等6個編碼細胞壁蛋白的基因顯著上調,正壬烷耐受性提高23%,gTME改造效果明顯優于單獨過量表達ABC轉運蛋白。因此,gTME通過修飾轉錄因子調控多個基因是提高酵母抗逆性的有效策略[15]。

3 gTME在代謝調控中的應用

gTME有強定向性,能高效生產各種代謝產物和縮短改造周期(表1)。MCKENNA等[16]利用gTME技術構建RpoD文庫篩選高效表達抗體的大腸桿菌,改造后RpoD僅包含第4區567-613氨基酸組成的截短體。在突變株基礎上過表達促進蛋白質折疊和組裝基因DsbA、DsbC和FkpA,得到最高抗體滴度達130.7 mg/L,效價比出發菌株提高13倍。gTME應用在改善微生物糖酸轉化率,如YU等[17]構建大腸桿菌RpoD和RpoS的隨機突變庫,其中rpoD突變株D72透明質酸產量最高,相比對照組提高35%。而單獨rpoD和rpoS過表達菌株產量增長不明顯,證明gTME技術可促進透明質酸積累。周筱飛等[18]通過gTME改造sigA,篩選出高產L-異亮氨酸的黃色短桿菌ART-1,產量達24.1 g/L,比出發菌株提高33.9%。目前gTME積累有益突變是非線性函數優化最快速基因改造方式之一,已成為提高底物消耗或積累能力、激活合成目標產物的高效方法。

表1 gTME提高工業微生物代謝的應用Table 1 Application of gTME in improving industrial microbial metabolism

4 gTME中定向進化和高通量篩選的應用

gTME可通過體外隨機突變技術引入遺傳多樣性,改進目標性能(表2)。例如,易錯PCR和DNA改組對σ因子和全局轉錄因子進行堿基突變或DNA片段重組,操作簡單且不需要深入了解序列和結構。隨機片段交換法(random insertional strand exchange mutagenesis,RAISE)將目標基因破碎、添加隨機短序列和重新組裝,可匯集多種突變形式,豐富gTME文庫種類。GAO等[20]利用RAISE技術對大腸桿菌rpoD隨機突變,將末端脫氧核苷酸轉移酶隨機添加到rpoD的3’末端,進行重新組裝生成突變文庫。采用低pH值脈沖對104液體突變庫進行表型篩選,最強耐酸菌株在pH=4條件下生長速率可提高2.8倍。可調基因間隔區(tunable intergenic regions,TIGRs)是指基因與基因間的一段非編碼序列,通過在全局因子σ70后插入TIGRs實現gTME改造,改變轉錄終止、mRNA穩定性和翻譯起始過程,增強甲羥戊酸代謝途徑上游atoB、hMGS和tHMGR等多個基因的表達轉錄,使甲羥戊酸產量增加了7倍[35]。隨著CRISPR/Cas介導的EvlovR、CRISPR-X和CasPER等新型進化技術出現,gTME改造可以同時靶向多個sgRNA誘發基因組位點突變,實現多重基因組工程,完成高效定向進化。HALPERIN等[36]使用EvolvR靶向進化rspE和rspL(核糖體蛋白亞基),與野生型相比全局突變率提高223倍,在20 mg/mL 壯觀霉素抗性下菌株數量提高16 000倍,顯著提高大腸桿菌耐藥性。因此,gTME可通過多種策略擴大目標突變范圍,提高微生物的定向進化能力。

表2 gTME改造方法Table 2 gTME modification methods

gTME應用局限主要為篩選難度和分析成本,實現gTME高通量篩選可以在滿足遺傳多樣性的同時,實現高效大規模篩選(圖2)。gTME的高通量篩選分為三類：(1)gTME改造可標記表型,根據瓊脂平板水解圈、抑制圈的大小及菌落形態等表型對乙醇和乳酸等耐受程度進行快速篩選。YIN等[37]利用gTME改造黃色短桿菌中σ因子編碼基因sigA,將突變文庫涂布營養缺陷平板,根據菌落生長圈直徑大小推斷異亮氨酸產量高低,篩選出突變株BF3的L-異亮氨酸產量達4.5 g/L,比出發菌株提高60%。(2)gTME改造代謝產量,通過測定可見光譜或熒光光譜吸光值對代謝產物實現快速檢測。HUANG等[38]利用gTME改造大腸桿菌CRP,用酶標儀測定472 nm處吸光值定量番茄紅素產量,24 h完成105文庫篩選,獲得的高產菌株MT-1番茄紅素產量達到18.49 mg/g DCW。CHOI等[39]利用gTME改造σ70因子篩選高產3-羥基丁酸脂(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)菌株,采用尼羅紅作為親脂熒光染料與PHB結合產生熒光,通過熒光強度反映細胞PHB產量,對5×105文庫高效率篩選得到最優菌株M54,PHB產量比出發菌株提高2.5倍。(3)gTME使用熒光生物傳感器將生物表型信號轉化為熒光信號,實現基因型和表型關聯。ZHANG等[40]采用改造NCgl0581(L-絲氨酸特異性轉錄因子)和黃色熒光蛋白相融合,構建生物傳感器質粒導入大腸桿菌生成gTME文庫,采用流式細胞儀進行熒光分選,以每秒數千次分辨速度完成1.2×105文庫篩選,篩選到的A36-pDser菌株可積累34.78 g/L絲氨酸,比出發菌株提高66.7%。此外,分子克隆和微生物篩選自動化平臺和工作站等高新技術設備使高通量篩選更加快捷高效,進一步拓展gTME工業應用。

圖2 gTME篩選流程Fig.2 Screening process of gTME

5 結論

gTME在微生物改造中具有廣闊的應用前景,可顯著擴大遺傳和性狀多樣性。本文主要介紹gTME全局調控機制,結合定向進化和高通量篩選實現在應變工程和代謝途徑中應用。在傳統基因工程技術中,受到載體構建和轉化效率等條件的限制,無法同時在多個基因位點進行改造,且對多基因控制表型的作用有限,而gTME在多基因控制生物合成和菌株育種等方面顯示出強大潛力。隨著gTME調控機制的深入研究及定向進化和高通量篩選的快速發展,未來gTME研究方向可以(1)著眼于各項轉錄因子的具體功能,進一步豐富全局轉錄調控元件,為利用gTME改善特定表型提供理論基礎;(2)深入探索RNAP其他亞基進行gTME研究的可行性,對轉錄關鍵環節突變產生更加寬泛的全局擾動;(3)拓展多策略組合的改造方式,精準高效篩選出各種理想表型和生理特性的菌株;(4)結合生物信息學、計算生物學和蛋白質功能結構等方法,完善gTME技術體系,提高目標產物的生產效率;(5)完善基因編輯定向改造工具和高通量技術,快速優化特定表型。在此基礎上,進一步闡明細胞代謝網絡的分子機制、穩定性和相互作用關系,為gTME在食品與發酵工業應用提供新思路。