水稻NACA基因家族的鑒定及NACA2功能研究

劉永昌，聶祝運，張 斌，袁志輝，何春蘭

(湖南科技學院, 化學與生物工程學院/湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南永州 425199)

新生多肽結合復合體(nascent polypeptide-associated complex，NAC)是由α(NACA)和β(NACB/BTF) 2個亞基組成的異源二聚體，能夠保護新生多肽，并引導新生多肽正確定位。結構分析發現，2個亞基的NAC結構域均存在于N端，且三維結構比較相似，但只有NACA的C端存在UBA (ubiquitin-associated) 結構域。另外，某些物種的NACB含有入核信號，而在NACA中沒有發現[1]。

目前，已經在丹參、玉米和水稻等植物中相繼克隆出NACB/BTF3基因，并對其功能進行了研究。在煙草和小麥中，BTF3基因影響了葉綠體和線粒體的發育，導致植株葉片顏色變黃，葉扭曲[2-4]。在水稻中，過量表達BTF3的轉基因株系在葉綠素含量、葉綠體數量、光合速率、葉片大小、株高、節間長等方面顯著增加或增強，而 RNAi株系的指標則明顯降低或減弱[5]。另外，沉默水稻BTF3使水稻花粉活力明顯降低，種子數量減少[6]。除了生長發育，NACB影響植物對逆境脅迫的響應。在擬南芥中過量表達互花米草NACB后，轉基因擬南芥葉綠素含量、脯氨酸含量增加，并且離子動態平衡加強，對鹽害和干旱有比較強的抵抗力[7]。在小麥中，沉默BTF3降低了植物對凍害和干旱的抵御能力[8]。沉默辣椒BTF3可以導致超敏反應引起的壞死細胞數量減少，同時超敏反應相關基因的表達量下降，煙草花葉病毒的外殼蛋白量增加[9]。過量表達水稻BTF3的轉基因水稻對高鹽和低溫脅迫抗性顯著增強，但抗旱性下降，而 RNAi轉基因株系的抗性則減弱[10]。綜上所述，NACB/BTF3不僅調控了植物的生長發育，而且在植物響應各種脅迫的過程中也發揮了重要作用。

雖然NACA和NACB可以形成異源二聚體，但是二者在細胞內的生物學功能并不相同。NACA可以直接或間接對靶基因進行轉錄調控，從而影響細胞分化、內質網脅迫、細胞凋亡等生物學過程[11-12]。作為新合成的多肽運出核糖體的通道組分，NACA可以結合到新生多肽鏈上，調節信號識別顆粒與新生多肽的結合，影響新生多肽轉移到內質網腔內[13]。在植物中，關于NACA功能的研究鮮有報道。有研究表明，煙草灰霉病PebC1與NACA同源。PebC1的誘導可以加快小麥的苗期生長速度，并且提高小麥的抗旱性。在番茄中，PebC1的誘導不僅可以提高植株對番茄灰霉病的抵抗能力，并且在PebC1處理后，植株中與抗病調節相關的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、多酚氧化酶的活性都有不同程度的增加[14]。蛋白組分析表明，水稻受到鹽和低溫脅迫時，NACA表達水平下調，但其具體生物學功能及作用機制仍然不清楚[15-16]。以上結果暗示，NACA可能在植物響應非生物脅迫的過程中發揮了重要作用。本研究從水稻中鑒定到5個編碼NACA蛋白的基因，并對其進行了生物信息學分析和表達模式的研究。同時，利用轉基因擬南芥初步研究了NACA2在植物抗旱過程中的功能，為進一步研究NACA基因在水稻抗逆過程中的生物學功能及作用機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞野生型，水稻為粳稻品種‘日本晴’(Oryzasalivasubsp keng)，農桿菌菌株EHA105、大腸桿菌菌株XL1-blue均由本實驗室保存。

選取飽滿無霉的水稻種子，去殼，然后用75%酒精消毒1～2 min，再用次氯酸鈉溶液消毒45 min，用無菌水沖洗4～5次，將其播種到MS培養基上，置于培養箱中(濕度為28 ℃，光照強度為6 000～8 000 Lx，12 h光照/12h黑暗)培養15 d。將水稻幼苗轉移至液體MS培養基中繼續培養2 d，然后用含有100 μmol/L JA、100 μmol/L SA、100 μmol/L ABA、300 mmol/L甘露醇和250 mmol/L NaCl的液體MS培養基及4 ℃低溫，分別處理0、1、3、6、12和24 h后取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 NACA蛋白的鑒定及生物信息學分析利用擬南芥NACA蛋白序列做探針序列，對Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中的水稻蛋白組數據庫進行比對分析，獲取基因號、基因組序列、轉錄產物序列、氨基酸序列。在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI保守結構域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測NACA蛋白結構域，進一步確定氨基酸序列中是否包含NAC和UBA結構域。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線預測NACA蛋白的等電點、分子量和不穩定系數。利用PSORT(HTTP://www.genscript.com/psort.html)預測NACA蛋白的亞細胞定位。利用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)在線分析水稻NACA基因外顯子-內含子結構。通過MEME(https://meme-suite.org/meme/)在線分析氨基酸序列中的保守基序，最短基序為5，最長的基序為50，共顯示10個保守基序。利用ClustalW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)對水稻NACA氨基酸序列進行比對分析，保存為MSF格式，然后利用GeneDoc對比對結果進行編輯。從Phytozome及NCBI數據庫中獲取臍形紫菜(Porphyraumbilicalis)、大豆 (Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等物種NACA同源蛋白序列，用MEGA6.0軟件采用鄰接法(Boot strap=1 000)構建系統進化樹，分析不同物種NACA的進化關系。

1.2.2NACA的表達模式分析利用MSU-RGAP(http://rice.uga.edu/index.shtml)數據庫獲取5個NACA基因在不同組織中的表達數據，利用HemI 1.0繪制表達量熱圖。

利用RNA提取試劑盒提取不同脅迫處理后水稻樣品的總RNA，利用反轉錄試劑盒(聚合美)合成cDNA，保存到-80 ℃備用。實時熒光定量PCR在美國伯樂CFX Connect上進行，利用NACA基因特異引物進行PCR擴增，以Actin基因做內參(表1)。反應體系為10 μL，分別包括1 μL cDNA，上下游引物各0.4 μL，SYBRgreen Mix 5 μL, ddH2O 3.2 μL；反應參數為94 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 45個循環。每次實驗設置3次重復，采用2-ΔΔCt法分析實驗結果，用Excel進行數據分析、繪圖。

1.2.3 NACA2的亞細胞定位利用基因特異引物 (表1)克隆NACA2全長的CDS (coding sequences)，用同源重組方法克隆到pBWA(V)HS。再利用35S啟動子驅動NACA2-GFP在水稻原生質體中表達融合蛋白，以空載體作為對照。將構建好的載體pBWA(V)HS-NACA2-GFP及核定位信號(nucleus localization signal, NLS)融合紅色熒光蛋白mkate的載體共同轉化水稻原生質體，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號，進行NACA2亞細胞定位。

表1 引物序列

1.2.4NACA2轉基因擬南芥對非生物脅迫的響應擬南芥種子通過10% NaClO消毒15 min，用無菌水清洗4～5次。將消毒后的種子鋪在1/2 MS培養基中，4 ℃處理3 d，轉移至培養室中(濕度為22 ℃，光照強度為6 000～8 000 Lx，12 h光照/12 h黑暗)。將萌發5 d后幼苗移至1/2 MS及含有150 mmol/L 甘露醇的1/2 MS培養基上，豎直培養，5～7 d后測量主根長。將萌發14 d后幼苗種植到營養土中，1周后開始停止澆水，進行干旱處理。出現干旱表型后開始拍照，復水，稱量不同株系地上部分重量。在土壤中生長2周后，剪取不同株系相同位置的葉片放置到稱量紙上，每個重復3個葉片，每隔3 h稱量1次，計算失水速率。實驗數據用Excel處理，每個實驗設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 水稻NACA基因的鑒定與生物信息分析

通過序列比對和結構域分析發現，水稻中共有5個NACA家族成員，命名為NACA1～NACA5，其中NACA1具有2個轉錄本。理化性質分析結果表明，NACA基因長度在578～2 759 bp之間，編碼蛋白分子量為12 943.14～57 239.89 Da，編碼的氨基酸長度為122～516 aa。NACA蛋白的等電點為4.28～8.63，其中NACA4的等電點為8.63，與其他蛋白差異較大。亞細胞定位預測發現，NACA蛋白亞細胞定位均為細胞核、線粒體和細胞質，但是定位在細胞核的可能性最大。蛋白的不穩定系數為48.73～71.82，其中NACA4為71.82，說明NACA蛋白均為不穩定蛋白，容易被降解(表2)。

表2 水稻NACA基因家族成員信息

進化和結構分析表明，NACA1和NACA3親緣關系最近，NACA2、NACA4和NACA5有較近的進化關系 (圖1和圖3)。親緣關系較近的蛋白也含有相似保守基序，基序分布也相似。NACA1和NACA3含有motif1、motif2、motif3、motif7，但不含有motif4。NACA2、NACA4和NACA5中都含有motif1、motif4、motif7 和 motif10 (圖1)。為了進一步研究NACA蛋白的結構，對水稻NACA蛋白序列進行比對。結果表明，NACA中含有3個保守區域，位于N端的富含天冬氨酸(D)結構域、位于中間的NAC結構域及位于C端的UBA結構域，其中NACA5與NACA4序列相似度很高，但缺少部分NAC結構域和UBA結構域 (圖2)。為了研究NACA蛋白的進化關系，將藻類、苔蘚、蕨類和種子植物中一些物種的NACA和水稻NACB構建了系統進化樹。結果表明，水稻3個NACB與進化樹中所有的NACA分化明顯，單獨分成一支，說明NACA與NACB的差別不僅在于是否存在UBA結構域，其蛋白序列也存在明顯的不同。不同物種中的NACA的分化與物種的進化關系相一致，親緣關系由遠到近分別為藻類 > 苔蘚> 蕨類> 種子植物。種子植物中的NACA分為2個亞家族，且每個亞家族中單子葉植物與雙子葉植物分化明顯 (圖3)。

A. NACA基因的基因結構；B. NACA蛋白保守基序分析

黑框內為富含天冬氨酸結構域；紅框內為NAC結構域，藍框內為UBA結構域

Pu. 臍形紫菜; Bb. 布朗葡萄藻; Cp. 角齒蘚; Mp. 傘地錢; Sm. 江南卷柏; Gm. 大豆; At. 擬南芥; Os. 水稻；Sb. 高粱

2.2 NACA基因的組織表達及誘導表達分析

基于MSU-RGAP數據庫的組織表達模式分析表明，NACA在水稻多種組織均有表達，且表達有明顯差異。NACA1和NACA3基因在水稻各組織中表達水平較高，在花序中的表達量最高，但在葉片、花藥、胚乳和授粉后10 d的種子中表達量較低。NACA2基因在水稻葉片、花和莖中有較高的表達量，在莖中的表達量最高，但在其他組織中表達水平較低。NACA4和NACA5基因在多數水稻組織中表達較低，但在莖和幼苗中表達量相對較高 (圖4)。

右側顏色標尺從藍到紅表示基因表達量從低到高。 1-13代表不同類型的水稻組織，分別為20 d的葉片(1)、抽穗后的花(2)、抽穗前的花(3)、愈傷(4)、雌蕊(5)、授粉后25 d A的胚(6)、授粉后5 d的種子(7)、授粉后10 d的種子(8)、圓錐花序(9)、授粉后25 d的胚乳(10)、幼苗(11)、花絲(12)和莖(13)

為了研究NACA基因對非生物脅迫的響應，通過qRT-PCR技術分析了5個NACA基因在JA、SA、低溫、ABA、NaCl和甘露醇處理后的表達模式。結果發現，在JA誘導后，NACA1、NACA2和NACA5的表達量先降低，后期略有升高，而NACA3和NACA4表達量變化不大 (圖5, A)。在SA誘導后，NACA1的表達水平隨處理時間的延長而升高，NACA2的表達量隨著處理時間的延長而降低，NACA4表現出降升降的表達趨勢，而NACA3和NACA5的表達水平則先升高再降低，分別在處理12 h和1 h達到最高值 (圖5, B)。在低溫處理后，NACA5表現出升降升降的表達模式，在處理后1和12 h出現高峰，其他基因變化不大 (圖5, C)。ABA處理后，NACA1和NACA4基因的表達量持續降低，而NACA1、NACA3和NACA5基因雖然在ABA處理后表達水平持續降低，但在處理24 h時表達量又增加 (圖5, D)。NaCl和甘露醇處理后，NACA基因的表達模式與ABA處理類似，都表現出先下降再上升的趨勢。NaCl處理后，NACA5的表達量表現為升降升的趨勢，處理1 h達到峰值，處理3 h達到最低值，然后升高 (圖5, E和F)。

A. 100 μmol/L JA；B. 100 μmol/L SA；C. 4 ℃；D. 100 μmol/L ABA；E. 250 mmol/L NaCl；F. 300 mmol/L 甘露醇。不同小寫字母表示不同基因同一時間差異顯著(P≤0.05)

2.3 NACA2的亞細胞定位分析

為研究NACA蛋白的亞細胞定位，構建NACA2-GFP融合蛋白表達載體，轉化水稻原生質體，利用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。結果顯示，GFP熒光信號分布在細胞核和細胞質中，NACA2-GFP融合蛋白的綠色熒光信號也分布在細胞質和細胞核中，與對照相似(圖6, A)。為了進一步明確NACA2是否定位在細胞核內，在水稻原生質體中共表達NACA2-GFP與核定位的NLS-mkate融合蛋白，進行共定位。結果表明，NLS-mkate具有明顯的核定位，二者在細胞核的部位能夠很好的重疊(圖 6, B)。由此表明，NACA2蛋白定位于細胞核和細胞質中。

A.NACA2在水稻原生質體中的亞細胞定位；B.NACA2與NLS-mkate在水稻原生質體中的共定位

2.4 過表達NACA2轉基因擬南芥抗旱性分析

為了研究NACA2的生物學功能，將其在擬南芥中過量表達，并通過qRT-PCR檢測轉基因擬南芥中NACA2的表達水平。結果表明，野生型擬南芥中檢測不到NACA2的轉錄產物，但其在轉基因株系中的表達量很高 (圖7，A)。

為了進一步研究NACA2對植物抗旱性的影響，將純合的轉基因株系和野生型進行干旱處理。干旱處理23 d后，野生型和轉基因株系都出現了明顯的萎蔫現象。相對于野生型，轉基因株系萎蔫程度較輕，顏色比較綠。復水處理后，擬南芥均開始恢復，葉片開始展開。與野生型相比，轉基因株系復水速度明顯更快，復水時間越長差異越明顯 (圖7, B)。復水后，轉基因株系地上部生物量均比野生型大，野生型為1.63 g，而轉基因株系分別為2.59和1.97 g (圖5, C)。葉片失水實驗表明，NACA2轉基因擬南芥的失水速率均比野生型慢。失水12 h后，株系9#的重量下降到原始重量的73.78%，而野生型為 55.57% (圖7, D)。另外，在含有甘露醇的培養基上生長1周后，NACA2過表達擬南芥的主根明顯長于野生型，說明NACA2過表達增強了擬南芥對滲透脅迫的抗性 (圖7, E和F)。

A.NACA2表達分析；B.抗旱實驗: 處理23 d(左)和復水5 h(右)；C.復水實驗；D.失水速率分析，不同小寫字母表示不同株系同一時間差異顯著(P≤0.05)；E、F.甘露醇抗性分析；不同小寫字母表示處理間差異顯著(P≤0.05)

3 討 論

相比于NACB，NACA在酵母和動物細胞中研究較多，在植物中的研究非常少，其生物學功能還不清楚。前人從水稻中鑒定了3個NACA基因，即NACA1、NACA2和NACA3，但本研究中還鑒定出了NACA4和NACA5。NACA4和NACA5編碼的蛋白序列的相似性較高，但NACA5蛋白序列較短，缺少部分NAC結構域和UBA結構域，可能是基因在復制的過程中出現了缺失。研究發現，NACA和NACB蛋白相似性不高，但他們的三維結構非常類似[17]。相比DNA，NACA同源二聚體的NAC結構域會更強烈地結合RNA，因此NACA被認為是RNA結合蛋白，可能在轉錄因子與染色質結合中發揮作用[18]。那么，水稻中的NACA能否獨立作為轉錄因子或輔助因子調控下游基因表達？NACA獨有的UBA結構域是一個廣泛存在于與泛素-蛋白酶體降解系統相關蛋白上的結構域。UBA不參與二聚體的形成，但是可以使二聚體更加穩定[19]。不穩定系數分析發現，水稻NACA的不穩定系數較高，在48.73～71.82之間，屬于不穩定蛋白。有研究表明，許多包含UBA結構域的蛋白質能特異地與泛素相互作用，依靠26S蛋白酶體調節蛋白的降解。因此，帶有UBA結構域的NACA可能具有獨特的生物學功能，如調控了NAC復合體或NACB的穩定性及定位。在水稻中，突變UBA結構域是否會影響NACA自身或NAC復合體的穩定性，最終改變水稻生長發育或響應脅迫的生物學過程？除了NAC和UBA結構域以外，水稻NACA蛋白的N端還存在一段富含天冬氨酸的肽段，但其具體功能還不清楚。SPARC (secreted protein, acidic and rich in cysteine) 是富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白，其N端為高度酸性區的結構域，富含天冬氨酸和谷氨酸，能夠以較低的親和力與Ca2+結合[20]。擬南芥細胞分裂素響應調節因子ARRS (Arabidopsisresponse regulators) 的N端也存在一個富含天冬氨酸的信號接收結構域，該結構域包括順式作用元件，也可以被磷酸化，從而調控其穩定性[21]。多效的轉錄因子PURα(purine-rich element binding protein alpha) 的C端具有富含谷氨酸和天冬氨酸的結構域，該結構域對于PURα與其他蛋白相互作用非常重要[22]。由此可見，富含天冬氨酸的結構域可能結合金屬離子、磷酸基團或與其他蛋白相互作用。因此，通過突變、刪除和編輯等手段系統研究NAC、UBA和富含天冬氨酸結構域的功能對于解釋NACA蛋白發揮作用的分子機理具有重要的意義。

NAC是一個具有多種功能的蛋白復合體, 包括保護新生肽鏈、調控新生肽轉位進入內質網和線粒體等。酵母和動物細胞中的研究表明，NACA在轉錄調控中起作用，能與輔激活類蛋白相互作用、激活骨鈣素基因、正向調控人紅細胞分化、調節肌發生等。有研究表明，煙草灰霉病NACA的同源基因PebC1可以加快小麥的苗期生長速度，并且提高其干旱抗性。在番茄中，PebC1蛋白的誘導不僅可以提高植株對番茄灰霉病的抵抗能力，并且在處理后，番茄植株中和植物抗病調節相關的苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、多酚氧化酶的活性都有不同程度的增加[14]，暗示NACA可能參與細胞應對外界環境脅迫的過程。水稻中，NACA2和NACA5受到高鹽、甘露醇、低溫、SA、JA處理的顯著調控，其中NACA2最為明顯。過表達NACA2減慢了擬南芥葉片的失水速率，增強擬南芥對干旱和滲透脅迫的抗性，但NACA基因在水稻響應外界脅迫過程中是否發揮了作用？另外，5個NACA基因具有明顯的組織表達特異性，尤其是NACA1、NACA2和NACA3在花、花序、種子和胚乳中的表達量較高。最近研究表明，擬南芥NACA5負調控了花粉管的伸長[18]。在水稻中，編碼β亞基的Osj10gBTF3影響葉綠體蛋白的輸入，從而調控了花粉的發育[23]。以上結果暗示，NACA基因可能在調控水稻生殖生長的過程中起作用。本研究對水稻NACA基因的表達模式進行分析，發現不同的基因具有明顯的組織和誘導表達模式，進一步研究發現NACA2基因調控了擬南芥對干旱和滲透脅迫的抗性。在后續研究中，通過過表達、抑制表達和基因編輯等手段深入研究NACA基因在水稻生長發育和抗逆過程中的生物學功能和作用機制，可以為豐富水稻抗逆的分子機制及抗逆育種提供了參考。