山茶CjMYB1基因的克隆及表達分析

黃 虎，馬先進，李思佳，李辛雷，李紀元，殷恒福*

(1 中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，杭州 311400；2 南京林業大學，南京 210037)

山茶(CamelliajaponicaLinn.)是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，是以觀賞為主要栽培目的的種、變種、品種等植物種質資源的統稱[1]。山茶在中國栽培歷史非常悠久，是中國十大名花之一，也是世界名貴花卉之一，其花團錦簇，色彩艷麗，具有較高的觀賞價值。山茶品種一般是在冬春季開花，其花期較長，花色、花型等變異豐富[2]。花色是其重要的觀賞性狀，現有的山茶品種花色主要為紅色、粉色，少量為白色、黃色、復色，例如金花茶組[Sect.ChrysanthaChang]中的金花茶(C.nitidssima)，其金黃色的花色獨特，形態美觀，觀賞價值極高，被譽為“植物界中的大熊貓”[3-4]。

花色的呈現與花瓣細胞中的色素種類和含量息息相關，目前研究發現類黃酮、類胡蘿卜素、甜菜色素和生物堿及其衍生物等是形成花色的主要因素[5]。在山茶花中，類黃酮化合物是主要的呈色因子，紅色山茶品種中主要是含有矢車菊素花色苷，黃色山茶品種中則主要是含有槲皮素，而白色山茶品種中不含有花色苷[2,6]。目前對山茶花色調控的分子機制研究報道比較少，姜麗娜、周興文對金花茶花色基因查爾酮合成酶基因(CnCHS)、二氫黃酮醇還原酶基因(CnDFR)、類黃酮糖基轉移酶基因(CnUFGT)、黃酮醇合酶基因(CnFLS)等研究發現，金花茶的黃酮醇類物質槲皮素-7-O-葡萄糖苷(Qu7G)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Qu3G)增加，可能是形成黃色花瓣的原因之一[7-8]。

MYB(Myeloblastosis)蛋白是植物轉錄因子中最大的家族之一，也是花色素生物合成中最廣泛的調節因子。MYB轉錄因子是一類DNA結合蛋白，有一段保守、可結合DNA的MYB結構域，該結構域約由52個氨基酸組成并含有一系列高度保守的氨基酸和間隔序列，這些保守的氨基酸可以使MYB蛋白結構域折疊成螺旋-螺旋-轉角-螺旋(helix-helix-turn-helix)結構[9]。MYB轉錄因子一般可以分為4類：單一結構域(R1/2、R3)蛋白、2個重復結構域(R2R3)蛋白、3個重復結構域(R1R2R3)蛋白和4個重復結構域(R1R2R2R1/2)蛋白。其中R1/2、R3蛋白成員主要參與植物的形態發生、次生代謝、生物鐘控制及花和果實的發育等生理過程。R2R3-MYB蛋白成員是植物MYB家族中數量最多的一類，廣泛參與植物初生和次生代謝、細胞分化、激素信號傳導、生長發育調控、生物及非生物逆境響應等生命過程。R1R2R3蛋白成員則在細胞周期控制方面起到重要的調控作用。而4R蛋白在植物中的功能知之甚少[10-12]。轉錄因子通過調控下游花色苷合成途徑基因影響花色苷的合成，進而調控花色的形成。最早報道的調控花色苷生物合成的MYB轉錄因子——玉米ZmC1基因，也是植物中首次報道的轉錄增強因子；與玉米中bHLH蛋白類ZmB或ZmR基因互作，進而激活花色苷合成途徑的二氫黃酮醇還原酶(DFR)啟動子和類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶(3GT)基因[13]。Schwinn等[14]在金魚草花瓣中克隆到3個R2R3-MYB轉錄因子Venosa、Rosea1和Rosea2，發現它們通過激活花色苷合成過程中不同關鍵酶基因的表達，進而影響花色素的積累。Li等[15]在觀賞植物紅掌中分離出2個R2R3-MYB轉錄因子AaMYB4和AaMYB5，他們在煙草中的異位表達導致T1代轉基因植株花色素的積累，并誘導煙草花色苷生物合成途徑關鍵酶基因表達上調。

目前對山茶中的MYB轉錄因子研究少見報道，本研究根據山茶花芽轉錄組數據庫進行序列比對分析，發現并克隆了1個MYB基因CjMYB1，對其進行了生物信息學分析，通過熒光定量PCR研究其在不同組織、不同花色品種中的表達模式，并開展亞細胞定位實驗，為后期深入了解山茶CjMYB1基因參與調控花色形成、花發育過程提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與采樣

選用4個色系7個品種的山茶花為試驗材料，包括花瓣為紅色的‘赤丹’、‘金碧輝煌’和野生紅山茶，花瓣為淡黃色的‘新世紀’、‘黃旋律’，花瓣為粉色的‘粉丹’，花瓣為白色的‘玉丹’。所有材料均來自于中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所山茶種質資源圃(119°95′E，30°07′N)。于2021年3月初選取生長態勢一致、健康茁壯的植株，并采集野生紅山茶花芽、嫩葉、花器官組織以及不同品種盛開期的花瓣鮮樣于液氮中速凍、研磨，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄合成cDNA稱取每個備用樣品100 mg，采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根，北京)說明書進行總RNA的提取，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑(TaKaRa，北京)說明書反轉錄合成cDNA。cDNA第1條鏈合成需要1～2 μg的總RNA，1 μL Oligo dT Primer(50 μmol·L-1)引物，1 μL dNTP，4 μL 5×Buffer，0.5 μL RNase抑制劑(40 U·μL-1)，1 μL PrimerScriptⅡ反轉錄酶(200 U·μL-1)，最后加入去離子水至總體積20 μL。反應程序為：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，冰上冷卻2 min。

1.2.2 目的基因克隆選取擬南芥、金魚草、矮牽牛中報道的花色相關MYB轉錄因子，通過本地Blastp(E=10-10)比對，在山茶花芽轉錄組數據庫[16]中，查找與MYB同源的cDNA序列，根據基因編碼區在Primer3 Plus網站(http://www.primer3plus.com/)上設計特異性引物(表1)，進而擴增cDNA片段。PCR擴增反應參照Premix Taq試劑(RR003A，TaKaRa，北京)說明書，體系為25 μL；擴增程序如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶正確的擴增產物回收，連接至T-vector pMD20載體上(TaKaRa，北京)，轉化大腸桿菌E.coliDH5α感受態細胞(TaKaRa，北京)，篩選陽性單克隆進行測序驗證，得到正確的目的基因序列。

1.2.3 目的基因的生物信息學分析對獲得的序列使用NCBI ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)來預測開放閱讀框(ORF)；使用ExPASy軟件(https://web.expasy.org/protparam/)分析其蛋白的理化性質；使用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白的二級結構；使用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白的三級結構；使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預測蛋白質的保守結構域；應用BioEdit軟件進行蛋白多序列比對；使用MEGA X軟件進行系統發育進化樹的構建和分析；通過WoLF PSORT II(https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar)在線網站進行CjMYB1蛋白的亞細胞定位預測。

1.2.4CjMYB1基因表達模式分析使用1.2.1的方法提取不同花色品種和野生紅山茶不同組織部位的總RNA，并用PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)試劑(TaKaRa，北京)反轉錄合成cDNA第1條鏈，根據克隆獲得的CjMYB1基因序列，設計熒光定量PCR引物(表1)，以GAPDH基因作為內參基因，使用TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑(TaKaRa，北京)進行熒光定量PCR反應，儀器為ABI 7300 Real-time PCR(美國)，反應體系為TB GreenⅡ 10 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，正向引物、反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，稀釋10倍的cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL，共20 μL。反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每個試驗和樣品均進行3次重復，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量，再使用SPSS 22.0統計分析軟件對結果進行差異顯著性分析。

表1 引物序列

1.2.5 亞細胞定位參照EXclone試劑盒(百格生物，江蘇)說明書將CjMYB1基因構建到含有35S啟動子的pCambia1300-GFP/C表達載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性單克隆菌落，經測序驗證后轉化至GV3101農桿菌感受態細胞(唯地生物，上海)中，于28 ℃培養2～3 d，挑取單菌落進行PCR鑒定。之后挑取鑒定過的陽性菌落，在含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，于28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養，使其OD600為1.0左右；4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體。用10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES-KOH、100 μmol/L乙酰丁香酮(As)制成侵染液重懸，室溫放置2～3 h，注射侵染本氏煙草葉片下表皮部位，放置于暗環境中培養2～3 d，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 CjMYB1基因的同源克隆

通過本地Blast比對，在山茶花芽轉錄組數據庫中找到一個同源的MYB基因并克隆，PCR擴增結果(圖1)顯示，擴增產物在1 000 bp左右，經測序該目標序列全長為998 bp。該基因的cDNA全長序列為1 314 bp，開放閱讀框(ORF)長為879 bp，編碼292個氨基酸(圖2)；將其命名為CjMYB1。該序列已經上傳提交至NCBI GenBank數據庫，登錄號為OL347930。

M. DL5000

圖2 CjMYB1基因的核苷酸序列及推導氨基酸序列

2.2 CjMYB1基因的序列特征分析

通過ExPASy軟件在線分析了CjMYB1轉錄因子的理化性質。結果表明CjMYB1編碼蛋白292個氨基酸，分子式為C1449H2315N437O437S10，原子總數為4 648，相對分子質量為33.17 kD，理論等電點為9.17，偏堿性；蛋白的不穩定系數為46.69，為不穩定蛋白，脂肪系數為78.77，總平均親水性(GRAVY)為-0.794，推測其為親水性蛋白。應用SMART在線軟件對CjMYB1基因所編碼的氨基酸序列進行保守結構域分析(圖3)，發現其具有MYB轉錄因子的典型保守結構域——SANT結構域，且含有2個，屬于MYB轉錄因子家族的R2R3家族；2個SANT結構域分別在第13～63和66～114個氨基酸處，在第262～276個氨基酸處有1個成分復雜度較低的區域。

圖3 山茶CjMYB1蛋白的保守結構域

通過SOPMA在線軟件預測了CjMYB1蛋白的二級結構，結果顯示，CjMYB1基因編碼的蛋白質由無規則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-折疊組成，其中無規則卷曲占54.45%，α-螺旋占27.05%，延伸鏈占11.64%，β-折疊占6.85%，其中以α-螺旋、無規則卷曲為主；進一步通過SWISS-MODEL在線軟件對CjMYB1蛋白的三維結構進行了分析，結果顯示(圖4)以6kks.1.A為建模模板，序列一致性為62.96%，CjMYB1在空間上具有MYB轉錄因子家族螺旋-螺旋-轉角-螺旋(helix-helix-turn-helix)的典型結構，與其對應的二級結構預測結果基本一致。

A. 蛋白二級結構預測：藍色. α螺旋；紅色. 延伸鏈；紫色.無規則卷曲；綠色.β折疊；B. 蛋白三維結構預測

2.3 CjMYB1蛋白多序列比對及系統進化分析

為了研究CjMYB1蛋白的功能與其他物種之間的進化關系，選擇了擬南芥、金魚草、矮牽牛、玉米等7個物種，發現他們均含有保守的R2R3-MYB結構域，且在R2、R3結構域里含有一段保守的motif，分別是RC[G/R]KSCRLRWxNYL[K/R]和LPGRT[A/D]N[D/E][I/V]KNxWN[S/T](圖5)。利用MEGA X構建NJ鄰接法系統進化樹(圖6)，發現CjMYB1和擬南芥R2R3-MYB家族第7亞組處于同一個分支，說明其與第7亞組進化關系最近；根據Dubos[10]報道，擬南芥第5、6、7亞組分別是與原花青素、花色素以及黃酮醇合成有關，表明CjMYB1可能參與調控植物次生代謝途徑黃酮醇物質的合成。

Cj. 山茶；Sl. 番茄；Ph. 矮牽牛；Md. 蘋果；Am. 金魚草；Pt. 楊樹；At. 擬南芥；Zm. 玉米；藍色. R2保守基序；綠色. R3保守基序；紅色方框. bHLH結合保守基序

圖6 山茶CjMYB1蛋白序列系統進化樹分析

2.4 CjMYB1基因組織特異性表達分析

采用熒光定量PCR方法，以GAPDH為內參基因，分析CjMYB1基因在野生紅山茶的花芽、花瓣、雄蕊、心皮、萼片和嫩葉中的相對表達量。結果(圖7)顯示，其在野生紅山茶各個組織均有表達，且在不同組織中呈現不同的表達模式。在嫩葉中表達量較低，在萼片、花瓣、心皮和雄蕊中表達量較高，而在花芽中表達量達到最高。推測CjMYB1基因在山茶花器官組織中發揮著很重要的作用。

FB. 花芽；PE. 花瓣；STA. 雄蕊；CA. 心皮；YL. 嫩葉；SE. 萼片；不同小寫字母表示在不同組織中基因表達差異顯著(P<0.05)

2.5 CjMYB1基因在不同花色品種的表達模式

為了研究CjMYB1基因在不同花色品種中的表達模式，選取了紅、黃、粉、白4個色系6個品種，采用熒光定量PCR方法進行檢測(同上)。結果(圖8)顯示，CjMYB1在野生紅山茶、紅色山茶品種‘赤丹’、‘金碧輝煌’中表達量較高，在野生紅山茶中表達量最高；在粉色品種‘粉丹’中表達量較低，而在淡黃色品種‘黃旋律’、‘新世紀’，白色品種‘玉丹’中幾乎不表達。由此可以看出，CjMYB1基因可能在紅色山茶品種的花色苷合成途徑中起到了關鍵作用。

Cj. 野生紅山茶；CD. 赤丹；JBH. 金碧輝煌；FD. 粉丹；YD. 玉丹；HXL. 黃旋律；XSJ. 新世紀；不同小寫字母表示在不同花色品種中基因表達差異顯著(P<0.05)

2.6 CjMYB1蛋白的亞細胞定位

通過WOLF PSORT II網站在線預測，CjMYB1蛋白定位在細胞核中。將CjMYB1基因構建到含有35s啟動子的pCambia1300-GFP/C表達載體上，與綠色熒光蛋白(EGFP)融合，通過煙草瞬時轉化，使用農桿菌介導，注射侵染本氏煙草的葉片下表皮細胞；同時用只含有EGFP的空載體做為對照。在激光共聚焦顯微鏡488 nm波長下觀察到，空載體的熒光信號在細胞核和質膜上都有分布，含有CjMYB1-EGFP的綠色熒光信號只在細胞核中觀察到，結果證實了CjMYB1蛋白定位在細胞核(圖9)。

圖9 CjMYB1蛋白的亞細胞定位(白色箭頭為細胞核)

3 討 論

R2R3-MYB轉錄因子是MYB轉錄因子家族中最多的一類，廣泛參與植物次生代謝、細胞分化、激素信號傳導、生長發育調控等生命過程[10]。目前在山茶中未見相關MYB轉錄因子研究報道，本研究則是以野生紅山茶和不同花色品種山茶為材料，采用PCR方法克隆了山茶CjMYB1基因，并對其進行了初步探索研究。該基因編碼292個氨基酸，且在N端含有兩個保守的SANT結構域，屬于典型的R2R3-MYB轉錄因子結構特征。

在擬南芥中，R2R3-MYB轉錄因子是包含100多個成員的MYB亞家族[17]，其中AtMYB123為第5亞組，參與種皮中原花青素的生物合成；AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113和AtMYB114為第6亞組，參與擬南芥營養組織中花色素的生物合成；AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111為第7亞組，參與黃酮醇的生物合成，且三者均參與調控查爾酮合成酶(CHS)、黃酮醇合成酶(FLS)、UDPG葡萄糖基轉移酶(UGT)等結構基因的表達[18-20]。MYB轉錄因子一般與bHLH、WD40轉錄因子互相作用形成MBW復合體來調控下游基因[21]，TT2-TT8-TTG1形成的MBW復合物(R2R3-MYB-bHLH-WD40)促進擬南芥種子原花青素的合成[22]，草莓的FaMYB9/FaMYB11，FabHLH3和FaTTG1的功能也與擬南芥AtTT2，AtTT8和AtTTG1相似，將這些基因轉到擬南芥tt2-1，tt8-3和ttg1突變體中，發現也能夠促進擬南芥合成花色素[23]。Gu等在牡丹中發現PsMYB12與bHLH和WD40蛋白之間相互作用形成轉錄調節復合物，直接激活了牡丹查爾酮合成酶基因(PsCHS)的表達并對牡丹花瓣斑產生影響[24]。本研究中發現CjMYB1與擬南芥R2R3-MYB家族第7亞組更為接近，但是AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111并沒有bHLH轉錄因子結合保守基序[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R[25]；推測CjMYB1可能是與山茶bHLH轉錄因子結合形成MBW復合體，參與調控植物次生代謝途徑類黃酮物質合成。

在山茶花色研究中，紅色和粉色花瓣中主要花色苷成分為矢車菊素-3-O-β-葡萄糖苷(Cy3G)和矢車菊素-3-O-[6-O-(E)-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷(Cy3GEpC)，黃色花瓣中主要成分為Qu3G和槲皮素-3-O-蕓香糖苷(Qu3R)，白色花瓣中則不含有花色苷成分[2,6]。本研究通過熒光定量PCR檢測，分析了CjMYB1基因在野生紅山茶不同組織、不同花色品種中的表達模式，發現其在野生紅山茶不同組織的表達量差異顯著，在花器官組織中表達量較高，在葉片中表達量較低，說明其可能參與調控了山茶花器官組織次生代謝途徑；在紅色山茶品種中表達量較高，而在粉、淡黃、白色品種中表達量較低；表明其可能參與了山茶矢車菊素花色苷的合成。后續還需要通過功能驗證進一步探索CjMYB1基因是如何參與調控山茶花色、花器官發育的分子機制。