山黧豆活性成分β-ODAP的檢測方法研究進展

楊玲娟，焦成瑾，張小寒，趙菲佚

(1 天水師范學院 化學工程與技術學院，甘肅天水 741001； 2 天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅天水 741001；3 中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083)

山黧豆(Lathyrussativus)不僅具有抗旱、耐寒、耐貧瘠等生物學特性，而且營養豐富(種子蛋白質含量可達25%～30%，將近是小麥的2倍)，一直作為優質的高蛋白小雜糧作物和飼料被廣泛種植與利用[1]。另外，山黧豆還具有很強的抗重金屬污染能力[2-3]，可作為環境修復植物用于重金屬污染土壤或濕地的修復。但是，山黧豆的內源活性物質β-N-草酰基-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α, β-diaminopropionic acid，β-ODAP)在高濃度時表現為神經毒性[4]，使其作為高蛋白質植物資源的利用和開發受到限制。其實，β-ODAP不僅存在于山黧豆屬植物中[5]，在豬屎豆屬[6]、金合歡屬[7]、蘇鐵[8]等植物的不同組織中也均有發現。在三七[9]、人參[10]、西洋參[11]等五加科名貴中藥材中也分離鑒定出β-ODAP，并被命名為三七素(dencichine)。研究表明，β-ODAP既是山黧豆神經中毒的活性成分，又是三七的止血活性成分，而且還具有抗菌、參與Zn2+轉運、清除羥基自由基、保護植物光呼吸代謝等其他生物活性；在山黧豆等豆類中，它還參與植物抗逆性等多種代謝反應活動[12-14]。然而，β-ODAP的同分異構體α-ODAP卻基本無生物活性(圖1)，在植物中含量也非常低，一般不超過5%(干重)[4]。

圖1 β-ODAP及其異構體α-ODAP

由于山黧豆神經中毒涉及β-ODAP的神經活性作用，自1964年被分離鑒定以來，β-ODAP一直被視為山黧豆種植與利用的負面因子。出于毒理學、山黧豆低毒品種的選育、β-ODAP生物化學合成及影響因素等研究需要，不同學者建立了一系列β-ODAP的檢測方法[14-15]。在三七、人參等中藥材中的發現和鑒定則不僅使人們認識到它的功能多樣性，而且極大地促進了其檢測技術的開發[16]。回顧這些檢測技術，一方面將幫助研究者選擇合適的β-ODAP檢測手段，另一方面將對開發其他氨基酸類植物次生代謝產物檢測技術提供有價值的參考。

1 傳統檢測法

β-ODAP是一種游離氨基酸，早期的含量測定多采用檢測氨基酸通用的分離及顯色方法，如比色法、層析法和氨基酸自動分析儀法等。比色法是利用ODAP堿水解后的產物α,β-二氨基丙酸(α,β-Diaminopropionic acid，DAP)與鄰苯二甲醛(O-Phthalaldehyde，OPA)在乙硫醇存在下能生成黃色化合物，在420 nm比色測定β-ODAP的含量[17]。該方法最早由Rao[18]創建，并經李志孝等[19]及Briggs等[20]進行了改進。該方法設備簡單、成本低、顯示靈敏，特別適用于大量樣品的篩選分析。例如，Priyanka等[21]利用此方法測定了孟加拉國100個栽培山黧豆品種的ODAP，含量范圍在0.13%～0.57%(干重)之間，并結合基因標記技術將這些山黧豆品種分成4個ODAP含量不同的組。Emmrich等[22]使用96孔板對比色法進行了改進并建立了檢測β-ODAP的高通量平板光度法。在此基礎上，郝曉鵬等[23]對137份國際山黧豆種質資源的葉片ODAP含量進行了檢測，并據此將其劃分為5個等級，其中高毒、低毒資源各8份[23]。在pH = 8時，β-ODAP的水解產物DAP在巰基乙醇存在下與OPA的反應產物具有很強的熒光(激發波長470 nm，發射波長530 nm)，借此建立了β-ODAP的熒光光度分析法，線性范圍為0.01～1 μg/mL，其靈敏度比普通可見光比色法高2～3個數量級[24]。

薄層層析(thin layer chromatography，TLC)和高效薄層層析法(HPTLC)采用吸附、分配、離子交換等不同分離介質，依據不同組分比移值的差異實現分離測定。Paradkar等[25]采用TLC法快速檢測ODAP以判定豆制品中是否摻雜了價格低廉的山黧豆，焦成瑾等[26]利用陽離子樹脂交換分離與TLC分離相結合，將ODAP與山黧豆中其他氨基酸完全分開。Tarade等[27]用正丁醇-吡啶-水(10∶10∶5,V/V/V)為展開劑、0.2%茚三酮溶液顯色、光密度儀測定ODAP含量，對3種烹飪方法加工的山黧豆食品中的ODAP降解動力學進行了詳細研究。章觀德等[28]利用熒光胺與β-ODAP反應，高效薄層層析法檢測了不同三七頭中β-ODAP含量，發現含量范圍在0.316%～0.382%之間。

氨基酸自動分析儀分析法是基于陽離子交換柱分離、柱后用茚三酮顯色、光度法測定氨基酸含量的分析方法。李天榮等[29]建立了山黧豆β-ODAP檢測的氨基酸分析儀法，并用來分析水分脅迫對山黧豆萌發過程中β-ODAP和氨基酸的影響[30]。此外，氨基酸分析儀法還用于三七、人參、鮮人參和紅參中的ODAP含量測定[31-33]，為這些藥材止血效果的評估提供了重要參考。

總之，傳統分析法儀器設備簡單，易實現，靈敏度和準確度也比較低，不能有效區分β-ODAP與α-ODAP，但特別適合處理大量篩選或分等級的樣品材料，尤其在野外或實驗條件比較差的研究中工作效率很高。因此，這一方法至今仍廣泛使用。

2 高效液相色譜法

2.1 直接檢測法

除芳香族氨基酸外，絕大多數氨基酸在近紫外區無吸收，因此不能直接用紫外檢測器測定其含量。ODAP分子中含有草酰基團(圖1)，而草酸本身有紫外吸收(210 nm附近)，因此，不少學者利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)以紫外檢測器直接測定生物樣品中草酸的含量[34-35]。國內三七等中藥材料的β-ODAP檢測方法主要基于此原理。崔秀明等[36]在213 nm處建立了三七中β-ODAP的直接HPLC檢測方法，發現云南文山產的三七中β-ODAP含量比較高，花蕾、莖葉、根莖、主根、側根和須根含量分別為0.86%、0.37%、0.88%、0.52%、0.41%和0.89%；付春梅等[37]在220 nm下檢測，發現云南三七制品中β-ODAP含量范圍在0.561%～0.582%之間；謝國祥等[38]將樣品抽提液在HPLC儀中直接進樣，在214 nm下檢測，從商品三七干燥根中分離純化了β-ODAP，并用質譜法進行了確認；張玉萍等[39]在213 nm下檢測發現商品三七片中的β-ODAP含量范圍在0.428%～0.435%之間；山麗梅等[40]在213 nm下系統檢測了云南文山三七產業園中的各種規格的三七頭，發現商品規格最差的“無數頭”中β-ODAP含量最高，可達1.02%，并且止血效果也最好，而商品規格最高的“13頭”至一般規格的“120頭”的含量在0.52%～0.69%之間，止血效果也一般，從而第一次發現三七頭的止血效果與商品規格不相關，而與β-ODAP含量呈正相關，進一步證明β-ODAP的止血效果；劉光等[41-42]利用HPLC在213 nm檢測了三七干燥根和根的總皂苷提取廢液中β-ODAP含量，為廢液中β-ODAP的回收利用提供了重要參考。

基于草酸紫外吸收的直接HPLC法操作簡單，但易受樣品中有機酸，尤其是游離草酸的干擾。本課題組采用此方法分析三七和山黧豆中β-ODAP含量時發現，在C18色譜柱中，草酸與β-ODAP的保留時間幾乎重合，而且草酸的存在會干擾β-ODAP與α-ODAP的有效分開。植物新鮮樣品中一般都存在含量可觀的草酸，尤其是山黧豆幼苗組織；另外，樣品加熱處理過程中也容易發生β-ODAP向α-ODAP轉化[43]，更重要的是直接檢測法顯然無法區分ODAP的兩種同分異構體，導致檢測結果偏高。因此，山黧豆等材料的β-ODAP檢測一般很少用此方法。

對于無明顯可見光吸收的物質來說，蒸發光散射檢測器(evaporative light scattering detector, ELSD)和電霧式檢測器(charged aerosol detection，CAD)也是HPLC中廣泛使用的通用檢測器[44-46]。樣品抽提液過濾后也可直接進樣進行檢測。通過ELSD檢測器[47]和CAD檢測器[11]分別對不同類型的三七及西洋參中的β-ODAP進行HPLC法測定，結果與其他檢測方法相似。

直接進樣檢測β-ODAP之所以能獲得比較準確的結果正是得益于HPLC的良好分離能力，即不管采用哪種檢測器，均遵循先分離再檢測。所以，只要能控制好β-ODAP和α-ODAP在HPLC柱子中的分離效果，理論上不管用哪種檢測器均能得到準確的檢測結果。

2.2 間接檢測法(柱前衍生法)

由于β-ODAP和α-ODAP的偶極距差別不大，即它們的極性很相近，在廣泛使用的C18色譜柱中很難完全分開。但是與適當的衍生化試劑反應后兩者產物的偶極距顯著增大(表1)[48]，這樣相應增大的極性差別足以使衍生物在C18柱中分開。這正是各種柱前衍生法的分離檢測優勢。

表1 β-ODAP和α-ODAP及其部分衍生物的偶極距[48]

柱前衍生檢測法解決了ODAP紫外吸收弱、極性強不易在色譜分析碳柱中保留、兩種異構體不易分離等問題，是測定β-ODAP應用最為廣泛的一種分析方法。但不同的衍生試劑，反應條件、衍生物穩定性、分離效果、β-ODAP保留時間等具有明顯差異。

2.2.1 鄰苯二甲醛衍生法氨基酸與OPA反應產物(圖2)既可以紫外檢測，也可以熒光檢測[49]，該方法檢測β-ODAP最早由印度學者Rao建立，后被稱為“Rao法”[50]。該方法操作相對簡單，準確靈敏，樣品量少；靈敏度比茚三酮高出10 倍；衍生試劑不干擾分離與檢測，不必除去過量試劑；能有效分離β和α兩種異構體。缺點是β-ODAP事先需要水解，衍生產物不穩定，需要及時測定，而且β-ODAP的出峰時間比較長。如Thippeswamy等[51]在β-巰基乙醇存在下，用鄰苯二甲醛衍生化山黧豆種子粉提取物，在340 nm下檢測得到β-ODAP的靈敏度為(1.54±0.04) mg/L，在C18柱中的保留時間為13.6 min。Hussain等[50]對6個不同實驗室的改進方法與Rao的原始方法進行對比，發現不同方法的檢測結果有明顯的出入。通過反復試驗，發現保證檢測結果重復性的關鍵是使用0.5 mol/L 四硼酸鹽作為緩沖液，并將這種新方法命名為Campbell法。

圖2 氨基酸與OPA的反應

2.2.2 9-芴基甲氧基碳酰氯衍生法9-芴基甲氧基碳酰氯(9-fluoreneylmethyl chloroformate, FMOC)一般用于合成多肽的氨基保護劑，與帶有伯及仲氨基的氨基酸反應可生成具有熒光(也有紫外吸收)的衍生物(圖3)。因此，可以利用FMOC作為柱前衍生試劑測定氨基酸[52]。Kisby等[53]針對OPA-DAP衍生物的不穩定性，建立了以FMOC為衍生試劑，熒光檢測ODAP含量的方法。對該方法改進后檢測山黧豆種子中ODAP含量，檢出限可達到皮摩爾(pmol)水平[54]。朱靜等[55]對三七根粉的檢測中，以硼酸緩沖液為反應介質，在室溫下僅需1 min即可完成反應。說明該方法靈敏度高，產物穩定，反應不受樣品基質的干擾，但缺點是無法區分ODAP的兩個異構體。不過，在山黧豆干種子和三七干根粉中幾乎不含α-ODAP。

圖3 氨基酸與FMOC的反應

2.2.3 異硫氰酸苯酯衍生法異硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate，PITC)是常見的氨基酸衍生化試劑(圖4)。它作為柱前衍生試劑可有效的區分β-ODAP和α-ODAP，衍生反應在室溫下僅10 min即可完成；產物在紫外區有強吸收(254 nm)，性質穩定，在室溫數小時或冰箱數周后均穩定不分解，表現出諸多優點。利用這種方法，Khan等[56]分析了山黧豆幼苗中的β-ODAP含量；Kuo等[57]發現β-ODAP廣泛存在于人參的種子、幼芽、秧苗和莖中。種子中β-ODAP的含量與山黧豆中的含量相近，占種子游離氨基酸的70%左右。對不同地區、不同基因型的山黧豆中β-ODAP及其他游離氨基酸分析發現，所有山黧豆樣品中的高精氨酸含量均為最高，β-ODAP次之；但不同品種的含量變化較大[58]。但是，衍生反應完成后需真空干燥以除去過量衍生試劑，衍生物不具有熒光，方法靈敏度不夠高，PITC易降低柱的壽命。

圖4 PITC與氨基酸的反應

2.2.4 2,4-二硝基氟苯衍生法蘭州大學李志孝課題組用2,4-二硝基氟苯(2,4-Dinitrofluorobenzene，FDNB)為衍生試劑建立了檢測β-ODAP可靠的方法[59](圖5)。1 mL樣品萃提液(或氨基酸標準溶液)真空干燥后加入100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液溶解，然后加入100 μL FDNB衍生化試劑(100 mg FDNB溶解于100 mL乙腈，每日新制)混勻，于60 ℃加熱30 min，冷至室溫，加入0.01 mol/L的KH2PO4溶液，旋混數秒，0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進行分析，β-ODAP和α-ODAP可良好分離。黃海霞等[60]采用此方法同時測定了三七不同部位三七素和18種游離氨基酸的含量。該方法的最大優點是β-ODAP和α-ODAP衍生物最先出峰(保留時間2～4 min)，大大縮短了分析時間。

1. β-ODAP；2. α-ODAP；3. 天冬氨酸；4. 絲氨酸；5. 谷氨酸；6.精氨酸；7. DNB-OH；8. 組氨酸；9. 高精氨酸；10. 蘇氨酸；11. 丙氨酸；12. 脯氨酸；13. 半胱氨酸；14. 酪氨酸；15. 纈氨酸；16. 甲硫氨酸；17. 賴氨酸；18. 異亮氨酸；19. 亮氨酸；20. 苯丙氨酸

張海霞等[61]和趙興秀等[62]進一步優化了色譜條件，采用恒組分洗脫測定了山黧豆中β-ODAP的含量，并對β-ODAP的提取方法進行了篩選。天水師范學院焦成瑾和楊玲娟課題組采用乙腈和HAc-NaAc(17∶83，V/V)為流動相，恒組分洗脫，使色譜峰峰形得到優化(圖6)[48]，在0.40 μg/mL～1.2 mg/mL范圍內線性關系良好；并以此分析了三七和山黧豆不同組織中β-ODAP和α-ODAP含量[63-64]。該方法的缺點是反應時間長(30 min)，反應溫度較高(60 ℃)，導致α-ODAP的比例升高，但轉化導致的誤差通過標準品消除，不影響檢測結果。

保留時間為3.576和4.073的峰分別為β-ODAP和α-ODAP的衍生物

2.2.5 其他衍生試劑法測定β-ODAP的柱前衍生試劑除了上述幾種之外，還有對硝基卞氧基碳酰氯(PNZ-Cl)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、6-氨基喹啉機-N-羥基丁二酰亞氨基甲酸酯(AQC)等。Jia等[65]和Yan等[66]利用PNZ-Cl為衍生劑在260 nm檢測了山黧豆中ODAP的兩種異構體，同時分析了其中的高精氨酸和生物胺的含量。該方法在室溫下2 min即可完成衍生，產物穩定，缺點是需梯度洗脫，ODAP的兩種異構體夾在其他氨基酸中間出峰。Dansyl-Cl衍生物法最早由Tapuhi等[67]提出，Xing等[68]將其應用于山黧豆中β-ODAP和α-ODAP的測定，衍生反應在60 ℃下25 min完成。該方法衍生物穩定，線性關系良好(相關系數為r> 0.999)，對β-ODAP的檢測限為2～3 ng、平均回收率為98%，可以將山黧豆樣品中游離氨基酸及α-ODAP和β-ODAP很好的分離；但反應時間需嚴格掌握。此外，AQC也可應用于測定山黧豆樣品α-ODAP和β-ODAP的含量[69-70]，其保留值分別為6.07和3.85 min，并且與其他氨基酸分離良好，但衍生物在室溫下易分解[71]。

總之，間接法通過與特定的衍生試劑反應，為ODAP分子引入苯環或共軛鍵，一方面使ODAP分子具有紫外吸收或發射熒光而便于檢測，另一方面還可以明顯改善分子的偶極矩，增大α-ODAP和β-ODAP極性差異，有效分離這兩種同分異構體。相應衍生反應的條件、需要的時間、產物的保留時間以及檢出限因衍生試劑而顯著不同(表2)。

表2 不同柱前衍生試劑檢測β-ODAP結果比較

3 色譜-質譜法

色譜-質譜聯用法是將高效率的色譜分離與高靈敏度的質譜鑒定相結合的分析技術，可以很好地解決復雜化合物的分離及分析問題。Pan等[8]用N-乙氧甲酰乙酯(N-ethoxycarbonyl ethyl ester，ECEE)作衍生化試劑，通過GC-MS技術對9種蘇鐵種子的成分進行了鑒定，發現其中2種蘇鐵種子(Macrozamiamoorei和M.communis)含有β-ODAP。Xie等[72]用氯甲酸乙酯(ethyl chloroformate，ECF)為衍生試劑，以2-氯苯丙氯甲酸乙酯為內標，測定了三七中β-ODAP及其他21種氨基酸的含量，β-ODAP的檢出限為0.5 μg/mL，提取液中含量為2 μg/mL。針對β-ODAP熔點高且存在異構化現象，朱靜等[73]選用液相色譜-質譜聯用技術研究三七素的兩個對映異構體在兔子體內的代謝動力學，發現D型、L型三七素在家兔體內的代謝行為基本一致，都符合二室模型；建立的HPLC-MS方法對D型和L型三七素的檢出限分別是10和8 ng/mL。張勇等[74]以羧甲司坦(carbocystelne)為內標，以甲醇為衍生試劑，生成三七素雙甲酯衍生物(羧甲司坦雙甲酯衍生物)，應用串連質譜(LC-MS-MS)法分析了三七素在大鼠及犬體內的分布、代謝和排泄情況，該方法的線性范圍為0.02～50 μg/mL，大鼠血液中β-ODAP的濃度檢出限為0.02 μg/mL，血漿中的提取回收率為97.1%。值得關注的是，采用穩定同位素標記的di-13C β-L-ODAP作為內標物進行高靈敏度LC-MS檢測，可準確測定山黧豆、豌豆和鷹嘴豆中低含量的β-ODAP，用以判定這些作物不同組織中是否含有β-ODAP[22]。這一同位素內標法被譽為測定β-ODAP的“金標準”。

4 毛細管電泳法

毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)技術是以高壓電場為驅動力，毛細管為分離通道，利用樣品中不同帶電微粒的電遷移速度不同而實現分離的一種手段。目前CE技術在藥物分析中有非常廣泛的應用[75]。鄭萍等[76]應用毛細管區帶電泳(CZE)，195 nm紫外檢測，測得三七藥材中β-ODAP的含量在0.583%～0.659 %之間，這個測定范圍與其他方法的測定結果相近。Arentoft等[77]及Zhao等[78]利用CZE測定了山黧豆種子、苗及葉中的β-ODAP和α-ODAP含量，測定結果與HPLC法的結果基本接近。CE法能徹底分離β-ODAP、α-ODAP，操作簡單，快速，成本低，適于對大量樣品的篩選測定。

5 酶 法

由于酶對底物具有高效且高度專一性的催化效率，利用酶對特定化合物進行識別和含量測定，即為酶分析法。Rao等[79]首先提出用酶法測定β-ODAP的方法。山黧豆樣品提取液經陽離子交換層析及酸水解后加入二氨基丙酸-氨裂合酶，37 ℃保溫45 min后加入0.2%的2,4-二硝基苯肼，于520 nm處比色測定，以無活性酶樣品為空白對照，方法可準確到5 μg。此外，可通過谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase，GlOx)催化β-ODAP氧化分解來檢測β-ODAP。GlOx氧化分解β-ODAP時會產生H2O2，H2O2在過氧化物酶(辣根過氧化物酶)的催化下氧化還原性染料使其變色，以光度法分析氧化前后吸光度的差異間接測得β-ODAP的含量[80](圖7)。十多年來，Moges等[71]為提高檢測靈敏度，對該方法進行了大量改進，但至今仍未開發出能實際應用的GlOx酶傳感器。Peng等[81]從綿羊瘤胃中分離到了形態不同的3種球菌，它們都可以分解利用β-ODAP。如果能從中分離出分解β-ODAP的酶，進一步開發出酶傳感器，則β-ODAP的檢測會更加簡便快捷，特異性好。

圖7 酶傳感器檢測β-ODAP的反應機理示意圖[71]

6 展 望

目前雖然已經明確β-ODAP的止血活性和神經興奮性作用，但兩種不同功能的分子機理至今不完全清楚，對β-ODAP多樣性生物活性涉及的分子機理進一步闡明將無疑拓展人們對這一神奇氨基酸的應用領域。進一步的深入研究需要純度較高的β-ODAP和高靈敏度的檢測方法。純品β-ODAP的獲取途徑不外乎從天然植物資源中分離提純和化學合成兩種途徑。近年出現的分子印跡(molecular imprinting，MI)靶向天然產物分離制備技術因其具有的特異性識別特點而受到廣泛重視[82]。該技術預先以天然產物活性成分或其結構類似物為模板分子，制備具有特異性識別功能的高分子聚合物，并以其為分離材料，從天然產物中分離得到目標活性成分。謝宏凱等[83]通過MI技術制備了對三七素具有高度選擇識別性和高吸附容量的聚合物，將此聚合物用作固相萃取吸附填料，定向分離制備了三七中的β-ODAP。吸附實驗證明分子印跡靶向聚合材料最大吸附容量為0.185 mmol/g，在15 min內即能達到吸附平衡，靶向分離三七素，其純度高達98.7%，平均回收率為83.7%。以MI為介質制備的小柱在β-ODAP檢測樣品前處理中也將會有事半功倍的效果。

除以上提及的β-ODAP主流檢測方法，還有一些屬很少使用但在特定場合下實用的檢測手段。目前，柱前衍生色譜法是β-ODAP研究中應用最為廣泛的分析方法。柱前衍生解決了ODAP紫外吸收弱、極性強、不易在C18柱保留、兩種異構體不易分離等問題。衍生試劑多樣，衍生簡單，分析效率高，大多能有效分離兩種異構體。毛細管電泳和液質聯用法因其高效的分離能力和高靈敏度被廣泛應用于極難分離組分的分離；穩定性同位素內標法的LC-MS被譽為檢測β-ODAP的“金標準”，可準確、靈敏、定性定量分析低含量ODAP樣品。由于ODAP熱異構化現象的存在，常溫提取，常溫檢測將是β-ODAP檢測方法努力的方向之一，因此，以MI法制備提取，以新型的特異性固定化酶電極或傳感器作為檢測手段將是未來β-ODAP分析檢測的研究方向。