基于中醫脾虛量表的結直腸癌患者臨床特征、腸道菌群及免疫功能相關性研究?

閆蘊孜， 孫凌云， 閆韶花， 吳 娜， 寧春暉， 楊宇飛△

(1.北京中醫藥大學西苑臨床醫學院， 北京 100029；2.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091)

結直腸癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一。據最新數據顯示，我國結直腸癌發病率和死亡率分別居全部惡性腫瘤的第4位和第5位，且發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1]。中醫認為結直腸癌病位在腸，病本在脾。“脾主運化”是脾最主要的生理功能，是指脾將水谷精微消化吸收并傳輸至全身的功能，其包括營養物質的消化吸收和物質轉化為能量的過程。有研究表明，能量代謝在腫瘤發病過程中扮演著重要角色[2]。因此，“脾失健運”可能通過能量代謝參與結直腸癌的發生發展[3]。

近年來有相關研究表明，腸道微生物參與結直腸癌的發生發展，進一步研究發現脾虛與腸道微生物之間存在著密切關系[4，5]。此外，中醫認為“脾為之衛”“四季脾旺不受邪”，素體脾氣虛弱易招致外邪侵襲，這也說明脾對邪氣具有抵御力。所以，脾主運化水谷、抵御外邪與腸道微生物的代謝以及機體免疫功能調節具有相似之處。由此可見，脾虛、腸道菌群與宿主免疫之間可能存在一定的相關性，平衡穩定的腸道菌群及免疫功能可能是維持“脾主運化”的一個重要條件。基于上述理論基礎及團隊前期研究，采用團隊自制中醫脾虛量表(traditional chinese medicine spleen deficiency scale, TCM-SDS)[6]，計劃從腸道菌群及細胞免疫角度進一步探索結直腸癌患者脾氣虛證的生物學特征，為進一步研究脾氣虛證的生物學機制提供客觀科學依據。

1 資料與方法

1.1 病例來源

納入2018年3月至2020年12月期間在中國中醫科學院西苑醫院、北京大學腫瘤醫院門診及病房就診的96例結直腸癌患者。

1.2 納入標準

有明確病理學診斷的結直腸癌患者；具備明確的臨床或病理學TNM(tumor node metastasis，TNM)分期；年齡18～80歲，性別不限；簽署知情同意書且依從性良好的患者。

1.3 排除標準

既往合并其他原發惡性腫瘤史；正處于化療期、放療期、靶向治療及免疫治療期的患者；合并嚴重心血管系統并發癥、腦血管系統并發癥、活動性肝炎、嚴重肝腎功能異常; 任何不穩定情況或可能危害患者安全及其研究依從性的情況，如精神分裂癥等嚴重精神疾病患者; 在入組治療開始特定期間內接受下列任何治療的受試者: (1)在2周內曾接受抗生素口服或靜脈輸液治療;(2)正在接受腸道菌群調節劑(如培菲康、乳酸菌素片)。

1.4 診斷標準

1.4.1 結直腸癌診斷標準 參照中華人民共和國衛生部醫政司《中國常見惡性腫瘤診治規范》[7]結直腸癌診斷標準。

1.4.2 TNM分期標準 參照美國癌癥聯合委員會(AJCC)第八版分期標準[8]。

1.5 相關信息采集

1.5.1 中醫脾虛量表 本研究采用中醫脾虛量表(TCM-SDS)進行分析，共5個條目。問卷采用5分制選項，分別為 “沒有=1、偶爾=2、有時=3、經常=4、總是=5”以評判患者脾氣虛的程度。研究分析過程中將對該量表分別計算總分，并且轉化為最高分為10分的分值以便進行分析與比較，同時將計算該量表平均值，將入組患者劃分為“脾氣虛”“非脾氣虛”組進行二分類變量的檢驗(詳見表1)。

表1 中醫脾虛量表

1.5.2 糞便樣本采集及腸道菌群檢測 研究所用的糞便采集試管套裝均由美吉生物醫藥科技有限公司提供。受試者需采集排便后10 min內的糞便，且避免尿液污染。在取樣后(常溫保存)14 d內寄送至研究者手中。研究者對糞便樣本進行編號標注后統一寄送至美吉生物醫藥科技有限公司。糞便腸道菌群樣本均由中國上海美吉生物公司采用16SrRNA分析方法進行檢測。

1.5.3 血液標本采集 采集受試者入組當天靜脈血2 mL裝入EDTA-K2抗凝管(紫色試管帽)，由中國中醫科學院西苑醫院血液實驗室、北京大學腫瘤醫院血液實驗室(流式細胞儀型號：Navios Beckman Coulter)分別對受試者樣本進行檢測，抗體選用CD3、CD25，HLA-DR，采用流式細胞術對T(CD3+CD4-CD8-/CD3+CD4+CD8+/CD3+CD4+CD8-/CD3+CD4-CD8+)、B 淋巴細胞亞群、NK細胞進行檢測。

1.6 統計學方法

1.6.2 糞便菌群樣本分析 將統計分析數據上傳至美吉生物云平臺(http://cloud.majorbio.com)，利用云平臺上的分析軟件進行腸道菌群樣本分析。基于 OTU 聚類分析結果，可以進行多樣性指數分析，2組間多樣性指數差異采用 Studentt檢驗或 Wilcoxon 秩和檢驗;基于分類學信息可以進行群落結果的統計，對于多組間差異性檢驗采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗 (Kruskal-Wallis H test)，2組間差異性檢驗采用 Student t 檢驗。

2 結果

2.1 人口學信息

本研究共納入96例結直腸癌患者，其中男性64例(66.70%)，女性32例(33.30%)(詳見表2)。

表2 受試者人口學信息特征

2.2 基于TCM-SDS量表的結直腸癌患者臨床特征分析

原發腫瘤部位、手術情況、病理類型、分化程度、是否造瘺、基因狀態、微衛星狀態各組間在脾氣虛程度得分比較差異無統計學意義(P>0.05)(詳見表3)。

表3 脾氣虛程度與結直腸癌患者臨床特征差異性分析

2.2.1 基于TCM-SDS量表脾氣虛分組的結直腸癌患者臨床特征分析 96例患者TCM-SDS量表平均分值為(3.92±1.71)，將TCM-SDS量表>3.9的患者劃分為“脾氣虛組”，將<=3.9分患者劃分為“非脾氣虛組”，對2組臨床特征及基本信息進行差異性比較。統計分析結果顯示，結直腸癌患者脾氣虛組與非脾氣虛組在原發腫瘤部位、手術情況、病理類型、分化程度、基因狀態以及微衛星狀態方面比較差異無統計學意義(P>0.05)(詳見表4)。

表4 脾氣虛與非脾氣虛結直腸癌患者臨床特征差異性分析

2.2.2 基于TCM-SDS量表脾氣虛分組與TB淋巴細胞亞群的差異性分析 統計分析結果顯示，脾氣虛組與非脾氣虛組在淋巴細胞(Lymphocyte)、雙陰性T細胞(double-negative T-cell,DNT)、輔助性T細胞(helper T cell，TH)、細胞毒T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,TC)、雙陽性T細胞(double-positive T cell,DPT)、總T細胞(T-lymphocyte)、總B細胞(B lymphocyte)以及自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)的比較中差異無統計學意義(P>0.05)；脾氣虛組與非脾氣虛組在NKT細胞絕對值比較差異有統計學意義(45.5,IQR 50.8 vs. 28 IQR 52, U=208，P=0.049)(詳見表5圖1)。

圖1 脾氣虛組與非脾氣虛組NKT細胞分布差異(左：2組NKT細胞絕對值差異性比較分析；右：代表性NKT淋巴細胞流式圈門圖)

表5 脾氣虛組與非脾氣虛組TB淋巴細胞亞群的差異性分析

2.3 結直腸癌脾氣虛與非脾氣虛患者腸道菌群分布差異

納入分析96例患者中共83例完成了糞便菌群樣本采集，共包含1336600條DNA序列。利用美吉生物云平臺(http://cloud.majorbio.com)進行生物信息分析，OTU物種分析顯示所有樣本中共包含微生物物種門水平27種，綱水平53種，目水平137種，科水平259種，屬水平615種，種水平1260,OTU水平3203種。Rank-Abundance曲線提示，所有樣本中種類較豐富(詳見圖2)。Pan/Core曲線分析提示曲線平滑，所查樣本量充足(詳見圖3)。

圖2 Rank-Abundance curves

圖3 Pan/Core曲線

2.3.1 物種組成分析 在屬(Genus)水平對脾氣虛組與非脾氣虛組進行物種組成Venn圖分析，結果顯示2組共有2066個共同菌種，脾氣虛組具有特殊菌種720個，非脾氣虛組具有特殊菌種1048個(詳見圖4)。

圖4 脾氣虛與非脾氣虛組腸道菌群物種分布Venn圖

群落Bar圖組成分析結果顯示，結直腸癌脾氣虛組、非脾氣虛組患者腸道菌群樣本中優勢物種在屬(Genus)水平的組成相同，包含有擬桿菌屬(Bacteroids)、普雷沃菌屬(Prevotella)、志賀菌屬(Escherichia-Shigella)以及糞球桿菌屬(Feacalibacterium)，但是其相對豐度不同(詳見圖5)。TNM分期群落Pie圖顯示，與脾氣虛組患者腸道菌群比較，非脾氣虛組患者腸道群落中的擬桿菌屬占比增加為29.79%；而普雷沃菌屬、志賀菌屬以及糞球桿菌屬占比減少，分別為3.72%、4.83%、3.86%(詳見圖6)。

圖6 脾氣虛組與非氣虛組腸道菌群樣本優勢物種分布Pie圖

2.3.2 物種組成差異分析 采用Student’s-t檢驗對結直腸癌患者脾氣虛組、非脾氣虛組患者腸道菌群在屬水平物種進行差異性分析，結果顯示非脾氣虛組中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)豐度顯著低于脾氣虛組，且差異有統計學意義(P<0.05)(詳見圖7)。

圖7 脾氣虛組與非氣虛組腸道菌群物種差異分析

3 討論

3.1 TB淋巴細胞亞群與結直腸癌脾氣虛證的相關性探討

研究結果中，脾氣虛組與非脾氣虛組在NKT細胞水平上差異有統計學意義。進一步分析發現，脾氣虛組NKT細胞絕對值水平較非脾氣虛組高。NKT細胞屬于特殊的T細胞亞群，具有很強的抗腫瘤活性。NKT細胞可以被IL-2(Interleukin-2、IL-2)、IL-15(Interleukin-15，IL-15)和IFN-γ(interferon γ，IFN-γ)等細胞因子激活產生應答[9]，活化后的NKT細胞可以通過分泌穿孔素、顆粒酶或Fas/FasL途徑殺傷某些腫瘤和病原體感染的靶細胞，也可通過分泌IL-4(Interleukin-4，IL-4)或IFN-γ參與體液免疫活細胞應答，增強機體抗感染和腫瘤的作用[10]；從中醫方面來說，中醫認為結直腸癌的發生發展多為“因虛致積”[11，12]，多因體內正氣不足導致人體防御能力下降。由此可見，正氣虧虛導致的免疫功能下降是惡性腫瘤發病的基礎，所以NKT細胞絕對值的變化，可能是反映脾氣虛變化的生物學指標。

3.2 腸道菌群對結直腸癌脾氣虛證的生物學特征預測

從群落組成分析結果來看，非脾氣虛組患者腸道群落中普雷沃菌屬、志賀菌屬以及糞球桿菌屬占比減少。有相關研究表明，普雷沃菌屬可以通過免疫炎癥反應基因的表達影響結直腸癌的發展。志賀菌屬、糞球菌屬被證明與腸道感染以及促進結直腸腫瘤細胞增殖有關，大都是通過誘導腸上皮細胞內超氧化物的形成，導致結腸上皮細胞的損傷造成炎癥感染[13，14]。結直腸癌脾氣虛證患者常以腹瀉、腹脹、腸鳴等癥狀為主，同時有大量實驗研究表明，脾虛會影響腸道菌群物種豐富度及數量的變化[15-18]，說明在脾虛狀態下機體代謝功能降低，其功能變化可能與腸道菌群組成及豐度變化有關。所以，通過這3種菌屬的豐度變化可以判斷，該菌屬可能會成為中醫治療結直腸癌脾氣虛的生物標志物。

脾氣虛組腸道菌群中雙歧桿菌屬豐度較高，很多研究證明，益生菌對抑制腫瘤的發生或緩解治療相關副作用是有益的。雙歧桿菌常被用于圍手術期預防腹瀉、感染等術后并發癥，也有研究報道，其可以用于提高癌癥的治療效率[19]。有研究報道，脾氣虛會導致腸道菌群失調，益生菌數量減少，導致腸道內短鏈脂肪酸水平的下降[20]。而本研究所納入的患者均經過一段時間的中藥治療以恢復手術導致的正氣虛損，中藥處方以健脾為主以恢復體內正氣。據相關研究報道，以健脾為主的中藥復方能夠提高脾虛型小鼠腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌的豐度[21-23]，所以脾氣虛組中雙歧桿菌屬豐度的增高可能與口服中藥治療相關，但其相關作用機制還需要進一步的研究。

本研究納入患者處在不同臨床分期和治療階段，所以脾氣虛的嚴重程度存在一定的差異。且此研究僅對“脾氣虛證”進行重點分析和探討，而在臨床實際中，患者的證型并不單一且無規范的統一診斷標準。在腸道菌群分析方面，本研究采用16SrRNA分析方法僅能夠對患者腸道菌群多樣性進行觀察與分析，而對于菌群功能預測欠佳。此外，課題組前期研究基礎發現，中藥干預后CD4T細胞絕對值明顯升高，并與放線菌中的雙歧桿菌具有顯著相關性，但此結果是否與機體脾虛狀態有關仍需進一步研究。本研究納入不同醫院結直腸癌患者在TB淋巴細胞亞群的實驗室檢測環境及試劑可能存在一定差異，但屬于可接受的系統誤差。未來我們可以通過對不同分期、不同治療階段進行分層分析，以比較不同狀態下脾氣虛證的差異，并進一步分析其與腸道菌群的相關性。此外，我們還可以通過宏基因組學方法進一步分析，以更加深入了解結直腸癌脾氣虛證與腸道菌群的相關機制。