扶正消癥方對(duì)乙肝相關(guān)肝癌TACE術(shù)后患者血清HIF-1α、E-cadherin的影響及其臨床意義?

賈 攀， 馬素平， 陳欣菊， 陳曉琦

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 鄭州 450000)

原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第四位，死亡率居惡性腫瘤第二位，5年自然病死率大于95%[1，2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，80%的肝癌患者是由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，HBV)慢性感染導(dǎo)致。乙肝相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為我國(guó)重大公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。

肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是目前治療原發(fā)性肝癌的常用方法之一，但相當(dāng)一部分患者發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，成為影響患者治療效果和生存期的一大難點(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移及低存活率緊密相關(guān)，其主要是指上皮細(xì)胞經(jīng)特定的生理或病理程序失去上皮特性而向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程，以細(xì)胞極性喪失、胞內(nèi)骨架蛋白重組、細(xì)胞間連接疏松并伴隨細(xì)胞侵襲遷移能力增強(qiáng)為主要表現(xiàn)。EMT發(fā)生最重要的標(biāo)志之一是E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)下降。TACE術(shù)后，由于栓塞了腫瘤的供血肝動(dòng)脈，腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧，在絕對(duì)缺血缺氧的肝癌組織中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達(dá)水平升高，HIF-1α可進(jìn)行缺氧反應(yīng)的基因調(diào)控[3]，其通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、刺猬信號(hào)通路等調(diào)節(jié)并降低E-cadherin表達(dá)水平。E-cadherin水平降低是發(fā)生EMT的標(biāo)志，說明腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力增加。HIF-1α、E-cadherin的表達(dá)水平與腫瘤的復(fù)發(fā)及進(jìn)展密切相關(guān)[4]。本研究以HIF-1α、E-cadherin作為主要血清學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察扶正消癥方對(duì)乙肝相關(guān)肝癌的臨床療效并探討其可能的作用機(jī)理。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)2018YL-019)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年12月至2019年4月在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽科、腫瘤科接受治療的乙肝相關(guān)肝癌TACE術(shù)后患者，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組各34例，其中試驗(yàn)組有1例(因未規(guī)律服藥)，對(duì)照組有2例(其中1例因未規(guī)律服藥，1例因未定期復(fù)查)剔除；進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析的共65例，其中試驗(yàn)組33例，對(duì)照組32例，分別對(duì)2組患者性別、年齡及治療前肝功能分級(jí)、肝癌分期、腫瘤活性、甲胎蛋白、肝功能、Karnofsky評(píng)分、中醫(yī)臨床癥狀積分進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[5]及《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。

中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：正虛瘀結(jié)證中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)、中醫(yī)臨床癥狀積分標(biāo)準(zhǔn)，參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[7]原發(fā)性肝癌中的肝癌證候診斷標(biāo)準(zhǔn)及十二五國(guó)家級(jí)規(guī)范教材《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》“癌病”的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合上述乙肝相關(guān)肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；原發(fā)性肝癌臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期；TACE術(shù)后2月內(nèi)，影像學(xué)證實(shí)體內(nèi)無活動(dòng)性病灶或可測(cè)量活性病灶較原病灶減少30%以上；年齡18～75歲，性別不限；一般情況良好，入組前1周內(nèi)Karnofsky評(píng)分≥60分；中醫(yī)診斷為正虛瘀結(jié)證；簽署知情同意書并能保證接受隨訪的患者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

5年內(nèi)或同時(shí)患有其他未治愈的惡性腫瘤；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)>5倍正常值和/或總膽紅素(TBIL)升高>5倍正常值；難治性腹腔積液、具有出血傾向、嚴(yán)重感染發(fā)熱和Ⅲ、Ⅳ期肝性腦病患者；嚴(yán)重心、肺、腎疾病，腦血管意外、嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥患者；孕婦和哺乳期病人；精神障礙疾病患者；過敏體質(zhì)或已知對(duì)本藥成分過敏者；正在參加其他藥物臨床試驗(yàn)或接受其他中藥治療者；研究者認(rèn)為其他原因不適合參加臨床試驗(yàn)者(如合并活動(dòng)性酒精性肝硬化或自身免疫系肝病)。

1.5 剔除、脫落、中止標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 剔除標(biāo)準(zhǔn) 病例選擇違反納入標(biāo)準(zhǔn)者；未按要求治療、未規(guī)律服藥、未定期復(fù)查等造成記錄數(shù)據(jù)不全者。

1.5.2 脫落標(biāo)準(zhǔn) 受試者自愿退出試驗(yàn)；受試者失訪；研究者判定因不良事件或異常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)值無法繼續(xù)試驗(yàn)；研究者認(rèn)為不宜繼續(xù)服藥者或認(rèn)為繼續(xù)試驗(yàn)有困難者。

1.5.3 中止標(biāo)準(zhǔn) 觀察對(duì)象發(fā)生了腫瘤復(fù)發(fā)；病情惡化或出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，不適宜繼續(xù)本研究者；治療過程中因其他原發(fā)疾病不適宜繼續(xù)進(jìn)行本研究者。

1.6 治療方法

對(duì)照組給予胸腺肽α1注射液(邁普新，成都地奧九泓制藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020545)，每次1.6 mg，皮下注射，每周2次；西醫(yī)內(nèi)科常規(guī)抗病毒治療；對(duì)癥處理，肝功能異常者給予保肝藥物治療；如有感染者根據(jù)情況給予抗感染治療、營(yíng)養(yǎng)支持等。

試驗(yàn)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上給予扶正消癥方(顆粒劑，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080036)，每日1劑，分2次早晚飯后沖服。扶正消癥方藥物組成：黨參15 g，薏苡仁30 g，水紅花子30 g，鱉甲10 g，柴胡6 g，白芍15 g，預(yù)知子15 g，壁虎3 g，雞內(nèi)金12 g，甘草6 g，2組療程均為9個(gè)月。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 ELISA測(cè)定血清HIF-1α、E-cadherin水平 HIF-1α、E-cadherin試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司(貨號(hào)E-EL-H1277c，E-EL-H0014c)，2組患者均于治療前和治療3個(gè)月后空腹采集靜脈血分離血清，-80 ℃冰箱保存，進(jìn)行HIF-1α、E-cadherin檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7.2 無進(jìn)展生存期(progression-free survial，PFS) 即患者從接受治療開始至觀察到疾病進(jìn)展或者發(fā)生因任何原因死亡的時(shí)間。疾病進(jìn)展評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考mRECIST實(shí)體瘤療效判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，隨訪時(shí)間截至到2020年1月。至最后隨訪時(shí)間未發(fā)生疾病進(jìn)展的患者，按照最后一次行腫瘤評(píng)估時(shí)間計(jì)算PFS。脫落病例終止時(shí)間為其最后一次隨訪時(shí)間，并記錄該對(duì)象為刪失。

1.7.3 Karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分與Karnofsky評(píng)分療效評(píng)價(jià) Karnofsky功能狀態(tài)評(píng)分采用國(guó)際通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，由美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組制定[10]。Karnofsky評(píng)分療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：改善：治療后較治療前評(píng)分提高≥10分；穩(wěn)定：治療后較治療前評(píng)分增減在10分以內(nèi)；降低：治療后較治療前評(píng)分降低≥10分。

1.7.4 中醫(yī)臨床癥狀積分 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[7]制定“原發(fā)性肝癌中醫(yī)臨床癥狀分級(jí)量化表”，按癥狀輕重評(píng)分，主癥輕度記2分，中度記4分，重度記6分，無癥狀記0分；次癥輕度記1分，中度記2分，重度記3分，無癥狀記0分。計(jì)算2組患者治療前及治療3個(gè)月后各癥狀的詳細(xì)積分并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清HIF-1α、E-cadherin表達(dá)水平比較

表1示，治療3個(gè)月后試驗(yàn)組HIF-1α較對(duì)照組明顯降低，E-cadherin較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。

表1 2組患者血清HIF-1α、E-cadherin表達(dá)水平比較 M(P25,P75)

2.2 PFS比較

最后隨訪時(shí)間截至2020年1月。治療3個(gè)月后，對(duì)照組進(jìn)展6例，試驗(yàn)組進(jìn)展3例；治療6個(gè)月后，對(duì)照組進(jìn)展15例，試驗(yàn)組進(jìn)展8例；治療9個(gè)月后，對(duì)照組進(jìn)展7例，無進(jìn)展2例，試驗(yàn)組進(jìn)展11例，無進(jìn)展10例。至最后隨訪時(shí)間未發(fā)生疾病進(jìn)展的患者，按照最后一次行腫瘤評(píng)估時(shí)間計(jì)算PFS。脫落病例：治療6月后，對(duì)照組脫落1例(患者因至外地工作退出臨床試驗(yàn))；治療9個(gè)月后，對(duì)照組脫落1例(患者失訪)，試驗(yàn)組脫落1例(患者因至外地退出臨床試驗(yàn))，屬于對(duì)象存活但中途失訪，終止時(shí)間按照其最后一次隨訪時(shí)間，并記錄該對(duì)象為刪失。

表2示，運(yùn)用生存函數(shù)(Kaplan-Meier)法對(duì)2組患者的無進(jìn)展生存期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明試驗(yàn)組治療后PFS較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。

表2 2組患者無進(jìn)展生存期比較(天，

2.3 血清HIF-1α與E-cadherin表達(dá)水平相關(guān)性比較

表3示，血清HIF-1α與E-cadherin之間存在中度的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

表3 血清HIF-1α與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性比較

2.4 血清HIF-1α、E-cadherin表達(dá)水平與PFS相關(guān)性比較

表4示，對(duì)患者血清HIF-1α、E-cadherin表達(dá)水平與PFS進(jìn)行相關(guān)性分析。Spearman相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-1α與PFS存在強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，E-cadherin與PFS存在中度的正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，提示HIF-1α水平越高E-cadherin水平越低，患者的無進(jìn)展生存時(shí)間越短，說明2指標(biāo)與患者PFS密切相關(guān)。

表4 血清HIF-1α、E-cadherin表達(dá)水平與PFS相關(guān)性比較

2.5 Karnofsky評(píng)分比較

表5示，2組患者治療3個(gè)月后Karnofsky評(píng)分均有所提高(P<0.05)；試驗(yàn)組治療3個(gè)月后Karnofsky評(píng)分較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)。

表5 2組患者Karnofsky評(píng)分比較(例)

2.6 Karnofsky評(píng)分療效評(píng)價(jià)比較

表6示，試驗(yàn)組治療3個(gè)月后Karnofsky評(píng)分療效優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 2組患者Karnofsky評(píng)分療效評(píng)價(jià)比較(例)

2.7 中醫(yī)臨床癥狀積分比較

表7示，2組患者治療3個(gè)月后中醫(yī)臨床癥狀積分均明顯下降(P<0.05)。試驗(yàn)組治療3個(gè)月后中醫(yī)癥狀積分較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。

表7 2組患者中醫(yī)癥狀積分比較(分，

3 討論

乙肝相關(guān)肝癌TACE術(shù)后復(fù)發(fā)率高、進(jìn)展快，西醫(yī)方面目前尚為無特異性藥物治療。多種因素及機(jī)制作用于肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，EMT是其最重要的機(jī)制之一。在肝癌的惡性演進(jìn)過程中，EMT與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、肝癌侵襲及低存活率緊密相關(guān)。TACE術(shù)后，肝癌組織的缺氧程度增高，缺氧條件下HIF-1α表達(dá)增加，可激活大量參與腫瘤生長(zhǎng)、糖酵解開關(guān)、血管生成和EMT的基因[11]，生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子和活性氧平衡改變，超過提供生長(zhǎng)的需要，造成肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。臨床病理學(xué)證據(jù)顯示，患者生存率與HIF-1α表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[12]。

E-cadherin是上皮細(xì)胞連接中最主要的黏附因子之一，被認(rèn)為是HIF-1α下游的靶點(diǎn)，有抗腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的作用。E-cadherin表達(dá)下降是EMT 發(fā)生最重要的標(biāo)志之一。研究表明，E-cadherin表達(dá)水平與肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展均有關(guān)[13-15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin與肝癌患者TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，E-cadherin表達(dá)低水平與低分化的患者預(yù)后差，且其通過Wnt/wingless信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[16]。大量研究均表明，HIF-1α、E-cadherin 是肝癌EMT過程中的重要靶點(diǎn)，成為當(dāng)今肝癌防治中的研究熱點(diǎn)。

導(dǎo)師馬素平認(rèn)為，乙肝相關(guān)肝癌屬于中醫(yī)學(xué)“癌病”范疇，肝癌多是在肝積的基礎(chǔ)上進(jìn)一步感受六淫邪毒或七情內(nèi)傷，情志抑郁或飲食失調(diào)，損傷脾胃，氣血化源告竭，臟腑氣血虧虛，內(nèi)生之邪郁結(jié)加重，正虛邪凝毒結(jié)，導(dǎo)致氣、血、濕、熱、瘀、毒膠結(jié)難化發(fā)為癌毒而成肝癌。針對(duì)肝癌正虛為本、氣血濕熱瘀毒互結(jié)為標(biāo)的虛實(shí)錯(cuò)雜病機(jī)特點(diǎn)，認(rèn)為扶正和祛邪是貫穿于乙肝相關(guān)肝癌治療的主線，治療當(dāng)以“扶正祛邪，攻補(bǔ)兼施”為原則，在臨床中通過不斷優(yōu)化精簡(jiǎn)用藥形成扶正消癥方，具有“益氣滋陰，軟堅(jiān)消癥”的功效，臨床應(yīng)用可有效延緩肝癌患者疾病進(jìn)展，改善癥狀體征，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。

扶正消癥方組成：黨參15 g，薏苡仁30 g，水紅花子30 g，鱉甲10 g，柴胡6 g，白芍15 g，預(yù)知子15 g，壁虎3 g，雞內(nèi)金12 g，甘草6 g。方中黨參補(bǔ)中益氣，切中肝癌正虛為本之病機(jī)，為君藥；薏苡仁健脾利水除濕，可增強(qiáng)黨參益氣補(bǔ)虛之功；水紅花子祛瘀消癥；鱉甲散結(jié)消痞，契合肝癌邪實(shí)為標(biāo)的病機(jī)，三藥輔助君藥加強(qiáng)治療主病主癥是為臣藥；預(yù)知子疏肝理氣散結(jié)，補(bǔ)氣而不滯氣；壁虎散結(jié)止痛，常用于治療癌腫，輔助臣藥增強(qiáng)祛邪之功；白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛，可緩解脅肋痞硬不適、肝區(qū)疼痛等次要癥狀；雞內(nèi)金有運(yùn)脾之功，增強(qiáng)黨參補(bǔ)氣之效；甘草緩和藥性，5藥共為佐藥；柴胡疏肝理氣，引諸藥入肝經(jīng)直達(dá)病所為使藥。此方攻補(bǔ)兼施，共同發(fā)揮益氣滋陰、軟堅(jiān)消癥的功效。方中的黨參[17]、薏苡仁[18]、水紅花子[19]、鱉甲[20]、預(yù)知子[21]、壁虎[22]、柴胡[23]等中藥經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，有提高E-cadherin表達(dá)水平，上調(diào)抑癌基因、下調(diào)促癌基因、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制肝癌細(xì)胞增殖等作用。

研究結(jié)果顯示，扶正消癥方可降低Ⅰ期、Ⅱ期乙肝相關(guān)肝癌TACE術(shù)后患者外周靜脈血血清HIF-1α水平，提高E-cadherin水平，延長(zhǎng)患者無進(jìn)展生存期，延緩肝癌復(fù)發(fā)，改善臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，值得進(jìn)一步深入研究與臨床推廣應(yīng)用。但仍需要對(duì)其抗肝癌的機(jī)制進(jìn)行深入探索，以更全面地評(píng)估扶正消癥方的安全性及有效性，優(yōu)化治療方案，為臨床廣泛應(yīng)用中醫(yī)藥治療肝癌奠定基礎(chǔ)。