1H NMR對(duì)煙草甲蟲蛀蝕款冬花前后化學(xué)成分的變化研究?

徐 博， 宋平平， 吳 翠， 李卓俊， 巢志茂△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所， 北京 100700；2.國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貯藏與包裝崗位， 北京 100700)

中藥款冬花為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，性辛、溫，味微苦，歸肺經(jīng)，具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰的功效，常用于治療新久咳嗽、喘咳痰多等癥[1]。與紫菀組成藥對(duì)治療咳嗽氣喘、肺纖維化[2-4]，與其他中藥組成咳喘寧膠囊提高機(jī)體抗氧化損傷的能力[5]；與射干等組成射干麻黃湯治療兒童哮喘發(fā)作[6]，在秋梨膏、百花丸中也有款冬花[7]。目前，在款冬花中已發(fā)現(xiàn)的成分有黃酮類、倍半萜類、三萜類、生物堿類、甾醇類及揮發(fā)油等[8，9]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗血小板活化因子等活性[10，11]?？疃☉?yīng)用歷史悠久，分布廣泛，主產(chǎn)區(qū)有河北晉州、山西長(zhǎng)治[12]、陜西銅仁等地，以河北產(chǎn)款冬花質(zhì)量最佳[13]。

藥材中夾雜活蟲或蟲卵，在適宜的溫濕度下，極易發(fā)生蟲蛀現(xiàn)象[14，15]。款冬花是容易遭受蟲害的中藥材之一，通常發(fā)生在每年的5～10月份[16]。一旦遭受蟲蛀，輕者表面出現(xiàn)蟲洞，嚴(yán)重者變?yōu)榉勰⒊霈F(xiàn)大量的害蟲排泄物、殘?bào)w及藥末粉渣等。蟲蛀后款冬酮的含量是否發(fā)生變化，蟲蛀對(duì)款冬花其他化學(xué)成分的影響，如何鑒定款冬花是否蟲蛀等，目前均未見(jiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，1H NMR在中藥質(zhì)量分析領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用[17，18]，與高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)等相比，不需要復(fù)雜的前期色譜分離或衍生化，將之與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合已逐漸用于中藥材的真?zhèn)?、產(chǎn)地、品種鑒別等研究[19]。本研究將1H NMR與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合，對(duì)款冬花蟲蛀后的化學(xué)成分變化進(jìn)行了研究和討論，為鑒定蟲蛀款冬花建立了判別方法，并為研究蟲蛀對(duì)中藥材質(zhì)量的影響提供了思路。

1 材料

AVANCE Ⅱ 400 MHz型核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)，DFT-50A型手提式高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，Ohaus CP224C型電子天平(奧豪斯(上海)儀器有限公司)，KQ-100E型超聲波清洗器(100 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)，DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，分析級(jí)甲醇(北京化工廠)，D2O、CD3OD(SIGMA)，CD3OD含0.03%三甲基硅基(trimethylsilyl，TMS)。

款冬花由陜西榆林清陽(yáng)中藥材種植基地李永亮提供。部分款冬花樣品經(jīng)煙草甲蟲蛀蝕后，出現(xiàn)了明顯的蟲蛀現(xiàn)象。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所巢志茂研究員鑒定樣品為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，蛀蟲為鞘翅目煙草甲蟲Lasiodermaserricorne(Fabricius)。

2 方法

2.1 樣品制備

本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象分為三種：第一種是質(zhì)量合格、未被蟲蛀的款冬花，粉碎過(guò)5號(hào)篩，稱為未蟲蛀款冬花；第二種是被煙草甲蟲蛀蝕后的款冬花，粉碎過(guò)5號(hào)篩，稱為蟲蛀款冬花；第三種是款冬花被煙草甲蟲蛀蝕后剔除蛀蟲，過(guò)5號(hào)篩獲得的煙草甲蟲排泄物，稱為排泄物。

分別精密稱取樣品粉末1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇密塞，稱定重量，超聲30 min(100 W，40 kHz)，靜置，冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，搖勻過(guò)濾，50 ℃減壓濃縮得提取物。提取物以D2O氘代后加入1.0 mL CD3OD，超聲溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取0.8 mL續(xù)濾液置于核磁管中以供測(cè)試。以上樣品分別平行制備3份。

2.2 1H NMR測(cè)定

將2.1項(xiàng)下制得的樣品溶液置于核磁共振波譜儀中進(jìn)行1H NMR圖譜采集。采集頻率400 MHz，傅里葉變換0.122 Hz，脈沖序列zg30，脈沖間隔1.00 s，溫度294.7 K，采樣時(shí)間域66 k，采樣時(shí)間4.09 s，掃描次數(shù)16次，譜寬8012 Hz。TMS為內(nèi)標(biāo)，CD3OD鎖場(chǎng)。

2.3 1H NMR圖譜處理及數(shù)據(jù)分析

將2.2項(xiàng)下采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MestReNova軟件(Version 9.0.1，Mestrelab Research SL，西班牙)中，相位自動(dòng)修正、基線調(diào)整，以內(nèi)標(biāo)物TMS為基準(zhǔn)校正化學(xué)位移。對(duì)δ8.00～0.00區(qū)間以每0.04 ppm作為積分單元進(jìn)行分段積分，積分中除去CD3OD溶劑峰δ3.31～3.35及水峰δ4.70～5.10。分別將各段的積分面積基于峰面積進(jìn)行歸一化處理，從而得到化學(xué)位移積分段與積分值對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-p 13.0軟件(Umetrics，Sweden)中進(jìn)行PCA、PLS-DA及OPLS-DA分析。結(jié)合VIP值，篩選差異顯著的化學(xué)成分，采用GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05)。

2.4 化合物指認(rèn)

根據(jù)款冬花中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式及相應(yīng)的化學(xué)位移、裂分情況和峰面積，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)歸屬。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 取同一份蟲蛀款冬花的樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下的測(cè)試條件連續(xù)測(cè)定6次，按照2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中計(jì)算相關(guān)系數(shù)，考察儀器的精密度。

2.5.2 重復(fù)性考察 按照2.1項(xiàng)下的制備方法平行制備蟲蛀款冬花樣品溶液6份，按照2.2項(xiàng)下的條件測(cè)定，按照2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中計(jì)算相關(guān)系數(shù)，考察其重復(fù)性。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 取同一份蟲蛀款冬花的樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下的測(cè)試條件測(cè)定其在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性，按照2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中計(jì)算相關(guān)系數(shù)，考察樣品在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

在精密度考察中，6組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明儀器的精密度良好；重復(fù)性考察中，6組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明重復(fù)性較好；穩(wěn)定性考察中，48 h內(nèi)各組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 1H NMR圖譜及信號(hào)歸屬

為探究款冬花蟲蛀后化學(xué)成分的變化，將款冬花蟲蛀前后的1H NMR圖譜進(jìn)行對(duì)比。未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花及排泄物的1H NMR圖譜見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，三種樣品具有相似的1H NMR輪廓，且由于各提取物中化學(xué)成分比較復(fù)雜，圖譜中化學(xué)信號(hào)重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，僅靠肉眼觀察獲得的信息有限，并不能全面、客觀、準(zhǔn)確地區(qū)別三者之間化學(xué)成分的差異。而多元統(tǒng)計(jì)分析可從大量、復(fù)雜、多維的數(shù)據(jù)中提取有效信息，建立數(shù)學(xué)模型對(duì)樣品進(jìn)行分類，并分析對(duì)分類具有較大貢獻(xiàn)的差異成分，從而實(shí)現(xiàn)差異性化學(xué)成分的篩選和分析評(píng)價(jià)[20]，故本研究采用多元統(tǒng)計(jì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

有研究從款冬花的生品和蜜炙品中報(bào)道了40個(gè)化合物[21]]，并進(jìn)行了生品與蜜炙品[22]、不同性狀[23]、不同來(lái)源[24]、莖和葉化學(xué)成分的比較等[25]。基于1H NMR圖譜，本研究根據(jù)化學(xué)位移、峰裂分及峰面積，共指認(rèn)33個(gè)化合物(詳見(jiàn)表1)。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)式及其質(zhì)子的化學(xué)位移，1H NMR圖譜大致分為三部分即氨基酸及有機(jī)酸區(qū)(δ3.10～0.70)，主要包括異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、檸檬酸、琥珀酸等；碳水化合物區(qū)(δ5.50～3.10)，主要包括蔗糖、葡萄糖等；低場(chǎng)區(qū)(δ8.00～5.50)，主要包括蘆丁、綠原酸、異綠原酸、腺嘌呤等。

表1 款冬花樣品指認(rèn)的化學(xué)成分

3.3 PCA

PCA是一種常用的多變量降維分析方法，可在盡量保留原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，把高維數(shù)空間的數(shù)據(jù)信息映射到低維數(shù)的少數(shù)主要成分(principal components，PCs)上。這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)化，便于數(shù)據(jù)特征的分析。將2.3項(xiàng)下得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-p軟件中進(jìn)行PCA分析(結(jié)果見(jiàn)圖2)。未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花和排泄物分別集中在不同區(qū)域，各自聚為一類，其界限清晰，無(wú)互相重疊，表明PCA可將蟲蛀款冬花與未蟲蛀款冬花進(jìn)行有效判別。在PCA分析中，R2X表示該模型中主成分的累積貢獻(xiàn)率，Q2表示預(yù)測(cè)模型中主成分的累積貢獻(xiàn)率，R2X與Q2的值越接近1.0，模型構(gòu)建越成功。結(jié)果顯示，前4個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為PC1：51.4%，PC2：37.5%，PC3∶5.0%和PC4∶3.4%，R2X為97.3%，Q2為88.3%，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。

圖2 未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花及排泄物的PCA得分圖

由于PCA是一種無(wú)監(jiān)督的模式分析方法，主要考察樣品在無(wú)監(jiān)督、自然情況下是否可以有效分類，僅能把具有相似特征的數(shù)據(jù)歸為一類，但不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差。為進(jìn)一步探究款冬花蟲蛀后化學(xué)成分的變化，本研究進(jìn)一步采用有監(jiān)督的方法PLS-DA及OPLS-DA進(jìn)行分析。

3.4 偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)

PLS-DA先將待分析樣品按原始屬性類別分組，再建立模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以利于最大化提取不同組別間波譜圖的差異，從而推導(dǎo)出存在差異的化學(xué)成分。將2.3項(xiàng)下得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-p軟件中(結(jié)果見(jiàn)圖3)。未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花和排泄物集中在不同的區(qū)域各自聚為一類，3種樣品之間界限清晰，無(wú)互相重疊。在PLS-DA中，常采用R2Y和Q2評(píng)價(jià)模型的質(zhì)量，R2Y主要反映模型的擬合程度，Q2則主要反映該模型的預(yù)測(cè)程度。R2Y及Q2值越接近1.0，說(shuō)明模型構(gòu)建越成功。前3個(gè)主要成分的R2Y為99.5%，Q2為96.3%，說(shuō)明模型構(gòu)建成功有效，這與3.3中PCA的分析結(jié)果一致，表明未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花和排泄物之間化學(xué)成分存在明顯差異。

圖3 未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花與排泄物的PLS-DA得分圖

為進(jìn)一步尋找出存在差異的化學(xué)成分，通過(guò)VIP>1.0及P<0.05進(jìn)行篩選，并結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，排泄物中異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、醋酸、1-O-乙基-β-D-葡萄糖苷、鼠李糖的含量升高明顯；而琥珀酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、肌酸、卵磷脂、乙醇胺、綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、3，4-O-二咖啡?？鼘幩?、蘆丁、甲酸、腺嘌呤、對(duì)羥苯甲酸、富馬酸、馬來(lái)酸、β-谷甾醇的含量下降顯著。

3.5 正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal patial lenst squares discriminate analysis,OPLS-DA)

OPLS-DA是在PLS-DA的基礎(chǔ)上結(jié)合正交信號(hào)，去除與Y矩陣無(wú)關(guān)的X矩陣變化，使不同組別的分類差別達(dá)到最大，從而更有利于尋找不同組之間存在差異的化學(xué)成分。從OPLS-DA得分圖(見(jiàn)圖4)中可以看出，未蟲蛀款冬花與蟲蛀款冬花均各自聚為一類且界限明顯。為驗(yàn)證模型的可靠性，本研究采用200次置換檢驗(yàn)(permutation test)，即將每個(gè)樣本標(biāo)記隨機(jī)打亂，再進(jìn)行建模和預(yù)測(cè)。R2和Q2在Y軸上的截距分別為0.169和-0.664。R2的截距幾乎接近于0，Q2的截距小于0.05，說(shuō)明模型出現(xiàn)過(guò)擬合的可能性較小，模型可靠。

圖4 未蟲蛀款冬花與蟲蛀款冬花的OPLS-DA主成分得分圖

圖5 OPLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果(n=200)

為進(jìn)一步尋找出存在差異的化學(xué)成分，通過(guò)VIP>1.0及P<0.05進(jìn)行篩選，并結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，與未蟲蛀款冬花中各化學(xué)成分的含量相比，蟲蛀款冬花中款冬酮的含量下降明顯。

4 討論

眾所周知，蟲蛀對(duì)中藥材的品質(zhì)危害極大。蟲蛀后的中藥材普遍存在著有效成分含量下降的現(xiàn)象，但如何進(jìn)行藥材蟲蛀前后的鑒別尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)此本研究采用易遭受蟲蛀的款冬花藥材進(jìn)行了初次嘗試。目前，1H NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析已在中藥材的品種比較[26]、真?zhèn)舞b別[27]、不同炮制品質(zhì)量的評(píng)價(jià)[28，29]等方面有了一定的應(yīng)用，采用1H NMR技術(shù)用于蟲蛀后研究，而PCA、PLS-DA及OPLS-DA可對(duì)未蟲蛀款冬花、蟲蛀款冬花進(jìn)行有效區(qū)分并推而廣之。此外，通過(guò)1H NMR特征圖譜峰共指認(rèn)出33個(gè)化合物，結(jié)合VIP值對(duì)蟲蛀前后含量變化顯著的成分進(jìn)行篩選。本研究為研究更多的中藥材蟲蛀變質(zhì)現(xiàn)象提供了新的思路與方法。

在煙草甲蟲蛀蝕款冬花后的排泄物中，綠原酸、異綠原酸等款冬花的次生代謝產(chǎn)物含量下降，說(shuō)明煙草甲蟲對(duì)這些次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了吸收和代謝。在其排泄物中異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸的含量明顯高于未蟲蛀款冬花和蟲蛀款冬花中的含量，推測(cè)這些成分是煙草甲蟲蛀蝕款冬花后通過(guò)代謝產(chǎn)生了更多的氨基酸。由于中藥材的有效物質(zhì)大多為次生代謝產(chǎn)物，其種類、含量及各成分之間的相對(duì)比例是決定中藥有效性和質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵[30]，被煙草甲蟲蛀蝕后，款冬花的次生代謝產(chǎn)物含量及相對(duì)比例均受到影響，推測(cè)其品質(zhì)和臨床療效也必然會(huì)受到影響?？疃鳛榭疃ǖ闹饕行С煞种唬哂忻黠@的鎮(zhèn)咳平喘作用[31]，是款冬花唯一含量測(cè)定的有效成分[1]，也可作為是否蟲蛀的標(biāo)志性指標(biāo)。異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸含量的升高，提示在進(jìn)行中成藥或提取物的提取和制備時(shí)，可通過(guò)制定限量值對(duì)款冬花的投料進(jìn)行控制。