滅活副干酪乳桿菌TK1501發酵紅棗飲品對葡聚糖硫酸鈉誘導的慢性結腸炎改善作用

劉成琪,霍姝伊,王寧宇,胡梅梅,牛新月,王海寬

(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

慢性結腸炎的病因是多方面的,通常表現為反復和持續的腹痛以及血性或化膿性腹瀉[1],發病早期腸上皮完整性被破壞,細菌及其產物穿過屏障滲漏,導致異常免疫反應和炎癥[2]。葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的結腸炎是應用最廣泛的化學誘導小鼠慢性腸道炎癥模型,其操作簡單,且和人類慢性結腸炎有相同的病理學[3]特性,包括結腸內膜上皮細胞的損傷,導致促炎性腸內容物擴散到潛在組織中[3-4]。近年來,研究人員發現慢性結腸炎和代謝紊亂之間存在相互作用,且它們的病理學具有共同的特征,包括代謝組織失調、炎癥以及免疫反應不足[4]等。雖然目前有有效的藥物來幫助控制結腸炎癥狀,如免疫調節劑、皮質類固醇、生物制劑和氨基水楊酸鹽,但其中一些藥物會導致嚴重的副作用[5]。因此,研究替代治療慢性結腸炎的方法尤為重要。

根據慢性結腸炎影響腸道微生物群和結腸的方式,目前益生菌和營養干預以其安全有效性越來越受歡迎。DING等[6]研究發現,短乳桿菌可改善DSS誘導的結腸炎,適當施用可能對宿主產生有益的健康影響,有助于緩解結腸炎癥狀。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) TK1501在進入人體后對機體的防御機制具有較強的耐受能力,可在人體腸道中大量存活并調節機體腸道菌群平衡,對人體的消化吸收功能有所增強。謝玉鋒等[7-8]從傳統發酵食品中分離篩選出L.paracaseiTK1501,通過發酵豆漿驗證得到產品具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,且該菌有較強的耐受能力,可作為緩解糖尿病的食品;源于L.paracaseiTK1501的β-葡萄糖苷酶對水解大豆異黃酮和合成糖苷發揮了重要作用。姜巖世等[9]發現,經過灌胃副干酪乳桿菌,小鼠免疫細胞顯著增殖,副干酪乳桿菌能夠調節小鼠免疫力。據報道,熱滅活微生物的制劑具有治療腹瀉、結腸炎、呼吸道疾病、腸道病變,以及對免疫系統的改變和改善腸道微生物群[10]的作用。經過滅活的微生物相較于活性微生物,保質期更長,且不易受溫度的影響,在環境溫度下便于儲存和運輸[11],因此熱處理滅活后的益生菌具有較好的發展前景。滅活后的益生菌對宿主有益,其中熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19具有良好的潤腸通便功能[12]。

紅棗營養豐富,富含維生素C、B1和B2以及類黃酮。紅棗不僅具有抗生育和抗糖尿病的作用[13],而且具有抗炎和止痛的特性。目前市場上所銷售的紅棗產品多以干制品以及粗加工為主,精加工棗產品種類較少。紅棗由于含糖量較高,發酵之后不僅增加了紅棗的營養價值,且口感良好,具有良好的市場前景。

本研究以DSS誘導的慢性結腸炎小鼠為模型,采用具有較強耐受能力且能夠調節腸道微生態平衡的L.paracaseiTK1501發酵滅活型紅棗飲品,探究L.paracaseiTK1501發酵的紅棗飲品對結腸炎的改善作用,以期為益生菌發酵飲品治療腸道疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

副干酪乳桿菌TK1501(L.paracaseiTK1501),保藏編號為CGMCC No.13130;寧夏同心圓棗干棗。

1.1.2 實驗動物

40只SPF級健康雄性BALB/c小鼠,體質量(20±2) g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司;飼養條件：12 h光照/12 h黑夜循環,溫度(22±2) ℃,濕度50%～60%,用固體普通鼠糧飼養,自由飲食飲水。實驗動物獲得動物實驗管理委員會(IACUC-JKX-2008-1)的批準。

1.1.3 試劑及儀器

MRS培養基,北京奧博星生物技術有限責任公司;葡聚糖硫酸鈉(MP級),百奧泰生物制藥股份有限公司;甲醇(色譜純),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;ELISA試劑盒,南京建成生物技術有限公司;便潛血試劑盒,萬馬醫療器械有限公司;1500酶標儀,芬蘭Thermo ELECTRON CORPORATION;Stepone Plus實時熒光定量PCR儀,ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.paracaseiTK1501棗漿發酵液的制備

料水比1∶4(g∶mL)的紅棗勻漿后進行巴氏殺菌,備用。在MRS培養基中培養L.paracaseiTK1501三級種子液,按體積分數為10%接種量接入紅棗勻漿中,37 ℃密閉發酵24 h。發酵完成后再次進行巴氏殺菌。

1.2.2 動物分組及模型的構建

40只BALB/c小鼠適應性飼養1周后隨機分組,分組采用隨機數字表法,每組10只,共分為4組,分別是空白組、DSS模型組、實驗組、對照實驗組,具體分組如表1。

表1 實驗分組Table 1 Experimental grouping

本實驗采用改良的自由飲用一定濃度的DSS溶液方法構建慢性UC模型。空白組小鼠實驗期間均不予干預,其余3組小鼠自由飲用30 g/L的DSS溶液進行建模,每次飲用時間7 d。第8天起改為飲用蒸餾水,每次飲用蒸餾水時間7 d,以上14 d為1個周期,整個模型構建階段共3個周期,合計42 d,實驗前期適應性喂養5 d,共計47 d。最后1個周期給予相應發酵液灌胃干預,模型組用生理鹽水進行對照灌胃,具體情況如表2所示。

表2 建模及給藥時間表Table 2 Modeling and dosing schedule

1.2.3 疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分的測定

實驗期間每天記錄小鼠體質量并觀察小鼠情況和便質,化驗便潛血。根據表3的評分標準進行各項評分,體質量下降率、便質、便潛血3項指標評分總和除以3即為小鼠DAI評分,參照公式(1)計算。

(1)

式中：a,體質量下降率評分;b,便質評分;c,便隱血評分。

表3 DAI評分標準Table 3 DAI scoring standards

1.2.4 炎癥因子的測定及結腸長度測定和固定

實驗終點采用眼球取血法收集血液標本,分離血清。嚴格按照酶聯免疫吸附ELISA試劑盒說明書檢測IL-4、IL-6、TNF-α、IL-1β細胞因子含量。取血后進行解剖,取出結直腸段,測量其長度,剪取0.5 cm左右的結腸組織放入40 g/L多聚甲醛中進行固定,送至津科生物科技有限公司進行切片制備。剩余結直腸冷凍備用。

1.2.5 蛋白表達量的檢測

將結直腸取出,通過RT-PCR技術,檢測結直腸中緊密連接蛋白ZO-1,Occludin,黏蛋白MUC2的表達量。

2 結果與分析

2.1 L.paracasei TK1501紅棗發酵液對UC模型小鼠DAI評分的影響

DAI是一種用于評價小鼠疾病程度的評分,評分結果見表4。與空白組小鼠相比,經30 g/L DSS誘導的小鼠體質量顯著降低,糞便為稀便或水便,糞便中的血液也肉眼可見。

表4 DAI評分記錄表Table 4 DAI score record

由圖1可知,DSS模型組的 DAI評分顯著高于空白組(P<0.01),表明UC模型成功建立;實驗組的DAI指數顯著低于DSS模型組(P<0.01),對照組的DAI指數與DSS模型組無明顯差異,說明副干酪TK1501發酵棗漿可以減輕結腸炎的疾病癥狀,對DSS誘導的結腸炎小鼠具有一定的保護作用。

BG-空白組;MG-DSS模型組;TG1-實驗組;TG2-對照實驗組(下同)圖1 小鼠DAI評分柱形圖Fig.1 Histogram of DAI score in mice

2.2 L.paracasei TK1501紅棗發酵液對UC模型小鼠結直腸長度的影響

結腸長度與結腸炎疾病具有密切相關性,是對UC評價的重要指標之一,圖2數據表明,本次試驗中空白組小鼠結腸長度最長,模型組小鼠的結腸長度顯著(P<0.01)短于空白組,而實驗組小鼠的結腸長度顯著(P<0.01)長于模型組。表明TK1501發酵的紅棗漿可有效恢復由DSS誘導的UC模型小鼠結腸長度,對結腸炎癥狀有輕微改善作用。

圖2 小鼠結腸長度柱形圖Fig.2 Histogram of colon length in mice

2.3 L.paracasei TK1501紅棗發酵液對UC模型小鼠細胞因子影響

參與炎癥反應的細胞炎癥因子主要可分為促炎因子和抗炎因子兩大類。當有炎癥發生時,血液中的細胞因子會發生相應的變化,促炎因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等會大量釋放,含量出現明顯增加,抗炎因子白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)的生成會被抑制,導致炎癥加劇[14]。圖3中模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著(P<0.01)高于空白組,其IL-4含量顯著低于空白組。說明實驗成功建立了UC模型,模型組的小鼠發生了炎癥反應,實驗組的IL-1β、IL-6、TNF-α顯著(P<0.01)低于模型組,IL-4含量顯著高于模型組。表明L.paracaseiTK1501發酵的紅棗漿可上調UC模型小鼠的抗炎因子,下調促炎因子,有效調節由DSS誘導的UC模型小鼠細胞因子含量,對結腸炎癥狀有一定改善作用。

2.4 L.paracasei TK1501紅棗發酵液對UC模型小鼠結直腸蛋白表達量的影響

有研究表明,Occludin蛋白是最具有代表性的緊密連接蛋白之一,它能夠封閉細胞旁路,使組織機構緊密連接。結直腸中的Occludin表達量過低容易導致腸的上皮屏障被破壞,引發一系列腸道疾病[15]。此外,腸道上皮中杯狀細胞分泌的MUC-2也是屏障的重要組成部分,MUC-2是黏蛋白的一種,對腸屏障的完整性恢復腸道正常功能具有重要意義[16]。經發酵飲品干預后的UC模型小鼠蛋白表達量的結果如圖4所示,模型組的Occludin、MUC-2蛋白表達量顯著(P<0.01)低于空白組,說明UC模型已建立,模型組小鼠腸道中連接蛋白和黏蛋白表達量降低,出現炎癥反應。實驗組的Occludin、MUC-2蛋白表達量顯著(P<0.01)高于模型組,表明經L.paracaseiTK1501紅棗發酵液干預后的UC小鼠結腸中鏈接蛋白和黏蛋白的表達量增加,腸道屏障功能有所恢復,結腸炎癥狀有效改善。

a-IL-4;b-IL-1β;c-IL-6;d-TNF-α圖3 小鼠細胞炎癥因子柱形圖Fig.3 Histogram of mouse inflammatory cytokines

圖4 小鼠結腸蛋白表達量柱形圖Fig.4 Histogram of protein expression in mouse colon

2.5 L.paracasei TK1501紅棗發酵液對UC模型小鼠結腸組織病理影響

病理切片觀察如圖5所示,圖5-a中杯狀細胞排列緊密隱窩結構正常,無明顯脫落現象和炎癥細胞浸潤現象;圖5-b中上皮細胞有輕度的脫落現象,杯狀細胞較為松散,隱窩結構輕度破壞,部分位置有少量炎癥細胞浸潤;圖5-c中有輕度脫落現象,隱窩結構輕度破壞,無炎癥細胞浸潤。通過病理切片觀察發現,TK1501紅棗發酵液干預后的結腸炎小鼠病理切片的炎癥現象有所改善,腸壁結構被破壞的現象也有所減輕。

a-空白組;b-DSS模型組;c-實驗組圖5 小鼠結腸病理切片圖Fig.5 Pathological section of mouse colon

3 結論與討論

慢性結腸炎在中國的發病率約0.12%,并且呈指數上升趨勢。近些年,隨著UC發病率的增加,其有效的預防和治療已成為慢性結腸炎研究重點。由于結腸炎的病因尚不明確,所以臨床上沒有針對此病癥的特效藥。目前用于治療慢性結腸炎的藥物均有維持效果不佳的缺點,一旦患有結腸炎除手術外很難痊愈,所以腸炎患者日常的飲食應多加注意。

副干酪乳桿菌代謝過程中會分泌或釋放對宿主產生有益影響的可溶性因子[17],包括胞外多糖、核糖體產生的多肽或蛋白質等具有免疫特性的物質,即后生素。在易感染患者和新生兒[18]等患者群體中,由于細菌要從腸道轉移到體循環,使用活菌會出現一定的安全問題,因此人們對使用熱滅活益生菌的興趣有所增加。細菌經過熱處理滅活后,作為益生菌的乳酸菌細胞表面的肽聚糖、磷酸壁、蛋白等成分對宿主具有有益作用。而且乳桿菌菌株分泌的代謝產物的有益效果更為顯著,其中包括蛋白質、肽、有機酸和其他小分子,由活細菌分泌或在細菌裂解后釋放到宿主環境中,并賦予宿主各種生理益處。目前關于熱滅活細菌對健康有益的現有證據表明,它們可以是脆弱人群(如新生兒)活益生菌的安全替代品[19],并且在兒童和成人胃腸疾病的管理中也有作用,包括腹脹和腹瀉[20]。乳桿菌屬物種通過分泌聚集促因子蛋白,即胞外蛋白,使乳桿菌菌株能夠在胃腸道定殖,并通過競爭排斥或與病原體共聚集來抑制病原體的黏附[21]。細菌素是一類核糖體合成的抗菌肽,具有殺菌或抑菌功能。YE等[22]報道了來自副干酪乳桿菌的細菌素具有耐高溫和耐酸的特性,對于許多食源性病原體具有廣譜抑制作用。

副干酪乳桿菌的代謝產物具有保護上皮屏障、抗腫瘤、免疫調節和對病原體的拮抗作用等有益功能[23],相較于菌體本身具有更長的保質期、清晰的化學結構和安全劑量參數等優勢。因此,使用益生菌代謝產物可能是活菌的有效和更安全的替代物,而且顯示出替代益生菌的良好潛力。目前,益生菌代謝產物在人類食品、動物飼料和制藥工業中的應用越來越多,幾種來源于乳酸菌代謝產物的產品可用于預防或治療某些疾病[23]。總言之,益生菌代謝產物作為人類或動物使用的預防或治療劑以及功能性食品或飼料添加劑具有良好的潛力。

本研究中通過L.paracaseiTK1501發酵的紅棗飲品具有改善結腸炎這一功能性。本研究的數據顯示,經L.paracaseiTK1501發酵的紅棗飲品可以顯著降低結腸炎小鼠的DAI,同時緩解結腸炎所造成的結腸萎縮。結腸炎模型小鼠細胞中促炎因子IL-1β、IL-6水平較高,抗炎因子IL-4水平較低,相關連接蛋白的表達量下降;L.paracaseiTK1501發酵的紅棗飲品的干預使促炎因子IL-1β、IL-6有所下調,抗炎因子IL-4有所上調。此外,L.paracaseiTK1501發酵紅棗飲品可以使結腸炎小鼠結腸中Occludin、MUC-2兩種蛋白mRNA相對表達量顯著升高,同時減輕結腸炎小鼠的病理學改變。這些結果表明L.paracaseiTK1501發酵的紅棗飲品具有改善慢性結腸炎的作用,是一款功能性飲品。此外,大量研究發現副干酪乳桿菌及其發酵產物可以調節腸道菌群,對腸道疾病有明顯的改善作用[24]。L.paracaseiTK1501發酵紅棗飲品還可能對腸道菌群及其代謝產物的含量有所影響,如短鏈脂肪酸等,此項研究工作目前正在開展,以期進一步闡述L.paracaseiTK1501發酵紅棗飲品對結腸炎的改善作用。

本文研究結果為紅棗發酵飲品的開發及營養應用提供了理論支持。紅棗中含有的抗氧化活性物質對人體有益,經發酵后的飲品經過巴氏殺菌后不含活菌,可以避免活菌攝入引起腸道菌群的改變。此飲品的研發具有積極的意義和應用價值。