天水秋椒葉黃酮的提取工藝優化

劉曉瑩，盧利平，2，金偉嘉，李佳怡，楊 揚

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生物醫學研究中心中國馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州 730030）

0 引言

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是蕓香科植物，一種歷史久遠的食物香料[1]。中國是世界花椒栽培面積與產量最大的國家[2]，在我國分布廣泛，北起東北南部，南至五嶺北坡，東南至江蘇、浙江沿海地區，西南至西藏東南部，常見于平原至海拔較高的山地，在青海海拔2 500 m的坡地也有栽種；耐旱、喜陽光，各地多栽種[3]。隨著政府部門精準扶貧工作力度的不斷加大和花椒價格高、效益好，甘肅省天水市甘谷縣將花椒栽植作為貧困山區精準扶貧精準脫貧產業富民的主要產業來培育，栽植面積逐年擴大[4]。秋椒作為當地特有花椒品種也隨栽植面積的擴大而增產增收，其花椒葉作為花椒的主要副產物，也是很好的調味品[5]，具有抗菌、活血、止痛等藥用價值[6-7]。且花椒葉化學成分組成豐富，近年來國內外對花椒葉的研究表明，花椒葉的主要成分為揮發油、黃酮、多酚、多糖、酰胺、香豆素等。豐富的化學組成使其具有多種生物活性，擁有良好的藥用價值，具有廣闊的研究前景[8]。人類心腦血管疾病、腫瘤、老年性癡呆、震顫麻痹癥等疾病幾乎都與氧自由基有關[9]。但花椒葉一直沒有得到良好的利用，造成了一定的資源浪費[10]。黃酮是一種很強的抗氧化劑，可有效清除體內的氧自由基，可以改善血液循環、降低膽固醇[11]，大大降低了心腦血管疾病的發病率，也可以改善心腦血管疾病的癥狀。黃酮類化合物具有很強的抑菌活性[12]。此外，黃酮類化合物具有降血糖、降血脂的作用[13-15]，還可清除高眼壓狀態下視網膜組織中產生的自由基損害，對高眼壓狀態下視網膜組織具有重要的保護作用[16]。響應面法（Response surface methodology，RSM）作為一種非常重要的試驗設計優化方法，在中藥提取工藝優化等方面得到廣泛的應用[17]。響應面法是將影響提取試驗結果的因素進行設計，按照設計方案進行試驗得到試驗結果。分析試驗因素和試驗結果之間的數學關系，進而得到最優的試驗條件[18-19]。關于花椒葉中黃酮的提取雖有報道，但對于天水甘谷縣花椒中秋椒葉的黃酮提取未見報道。以當地秋椒葉為原料，通過超聲輔助提取、單因素試驗法、響應面法優化秋椒葉總黃酮的提取工藝，得到了較高的黃酮提取率，從而提高甘肅天水秋椒葉的利用率，變廢為寶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秋椒葉，2020年5月采摘于甘肅甘谷縣大象山鎮；丙酮、無水乙醇、蒸餾水、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，蘭州市奧科生物技術有限公司提供；蘆丁標準品，Solarbio公司提供。

WJX-200型高速多功能粉碎機，江陰市億豐機械設備有限公司產品；SB-500DTY型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；BSM-120型電子分析天平，上海坤誠科學儀器有限公司產品；DT5型離心機，上海京工實業有限公司產品；HHS4A型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品；DHG-9420A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；MHY-19642型可見分光光度計，北京美華儀科技有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 花椒葉總黃酮提取工藝流程圖

秋椒葉干燥→粉碎過篩→脫色處理→超聲提取→離心→黃酮提取液。

1.2.2 原料處理

摘取新鮮的秋椒葉洗凈，在70℃烘箱中烘至恒質量。粉碎花椒葉并過80目篩，經丙酮溶液浸泡過夜，抽濾，得到脫色處理后的干燥秋椒葉粉，裝入封口袋中密封保存，備用。

1.2.3 提取

準確稱量1 g秋椒葉粉于比色管中，超聲頻率40 kHz，功率比60%，在特定體積分數的乙醇溶液、液料比、超聲時間、超聲溫度下進行超聲波輔助提取。以轉速12 000 r/min離心15 min，收集提取液2次后將濾液合并，最終提取液定容至50 mL。

1.2.4 黃酮含量的測定

移取0.5 mL提取液到10 mL具塞試管中，用體積分數80%乙醇溶液補至5 mL，加入質量分數5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，反應6 min，再加入質量分數4%NaOH溶液4 mL，混合均勻后用蒸餾水定容至刻度線，15 min后于波長510 nm處測定其吸光度（A510）。秋椒葉中黃酮濃度依據標準曲線推算，并計算黃酮的得率[20]。

式中：

Y——秋椒葉總黃酮得率，%；

C——測得的黃酮質量濃度，mg/mL；

V——秋椒葉樣品定容體積，mL；

n——稀釋倍數；

m——秋椒葉樣品質量，g。

1.2.5 蘆丁標準曲線的繪制

配制特定質量濃度的蘆丁標準品溶液。分別吸取體積0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL的蘆丁標準品溶液置于10 mL具塞試管中，加入80%乙醇溶液定容至5 mL，混合均勻后同1.2.4操作方法進行反應后，于波長510 nm處測定其吸光度（A510）[21]。

1.3 單因素試驗

按照1.2.4中的試驗步驟，分別研究不同梯度單因素對秋椒葉黃酮提取率的影響。設置各單因素梯度為乙醇體積分數（45%，50%，55%，60%，65%，70%）；浸提時間（20，30，40，50，60，70 min）；浸提溫度（40，45，50，55，60，65℃）；料液比（1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45（g∶mL））。

1.4 試驗因素水平選取

根據單因素試驗所得的提取工藝條件，以秋椒葉黃酮得率為響應值，選取乙醇體積分數（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）4個因素作為考查變量，依據如表1所示的試驗因素和水平設計進行響應面試驗設計，優化秋椒葉黃酮的提取工藝。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

通過標準曲線得到標準曲線方程為Y=8.687 1X+0.002 6，相關系數R2=0.999 3，且在質量濃度0.01～0.05 mg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

乙醇體積分數對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

由圖2可知，當乙醇體積分數為55%時，黃酮得率達到最高。依據相似相溶原理可知，黃酮溶于乙醇的量與兩者極性密切相關，秋椒葉中黃酮的極性與55%的乙醇溶液相近，故此時得率為最大值。隨著乙醇體積分數繼續增大，黃酮得率下降。因此，根據秋椒葉黃酮得率曲線走勢，選取50%，55%，60%的乙醇體積分數進行響應面優化試驗設計。

2.2.2 超聲時間對黃酮得率的影響

超聲時間對黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，在一定時間范圍內，秋椒葉黃酮得率呈現先增加后減少的變化規律，在超聲時間為50 min時，黃酮得率最高為19.51%；超過50 min后，黃酮得率曲線呈現緩慢下降趨勢。根據秋椒葉黃酮得率曲線走勢，超聲時間選取40，50，60 min進行響應面優化試驗設計。

圖3 超聲時間對黃酮得率的影響

2.2.3 超聲溫度對黃酮得率的影響

超聲溫度對黃酮得率的影響見圖4。

由圖4可知，當超聲溫度為40～55℃時，黃酮得率隨著超聲溫度的上升而增大，當溫度超過55℃后，秋椒葉黃酮得率開始下降。這是因為適宜的溫度范圍能夠提高黃酮分子的運動速率，從而提高黃酮的溶出，但是高于一定的溫度界限，黃酮結構被破壞，溶出量減少，其他雜質的析出比例上升，因而黃酮得率會有所降低。根據秋椒葉黃酮得率曲線走勢，超聲溫度選取50，55，60℃進行響應面優化試驗設計。

圖4 超聲溫度對黃酮得率的影響

2.2.4 料液比對黃酮得率的影響

料液比對黃酮得率的影響見圖5。

圖5 料液比對黃酮得率的影響

由圖5可知，在料液比為1∶20～1∶35時，黃酮得率隨著料液比的升高而升高，當料液比超過1∶35后，黃酮得率呈下降趨勢。這是由于料液比比較低時，秋椒葉中黃酮不能夠完全溶出；隨著溶劑量增加，雜質溶出量增加導致黃酮提率降低，過量的乙醇導致黃酮損失。根據秋椒葉黃酮得率曲線走向規律，料液比選取1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）進行響應面優化試驗設計。

2.3 響應面設計結果與分析

2.3.1 響應面法試驗設計結果

基于單因素試驗結果，通過Design Expert 8.06軟件設計，以乙醇體積分數（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）為自變量，以秋椒葉黃酮得率為響應值進行響應面分析，其中25，26，27，28，29是中心試驗，其余為析因試驗。得到黃酮提取液的擬合回歸方程為：

響應面設計方案及結果見表2。

表2 響應面設計方案及結果

回歸方程方差分析見表3。

由表3可知，通過p值可知，對黃酮得率影響極顯著的因素為C，A2，B2，C2，D2，說明試驗因素與響應值之間，對其影響較大為二次項，四因素之間交互作用不顯著。整體模型的p值＜0.01，差異極顯著（p＜0.01），表明回歸方程模型顯著，失擬項p值為0.050 4，較顯著（p＜0.05），表明該模型的擬合度較好，變異系數CV=7.74，說明試驗可操作性較好。該模型的決定系數R2=0.923 0和R2Adj=0.864 5。綜上所述，該模型可以用于秋椒葉中黃酮得率理論值的進一步分析和預測。通過F值可得，各因素對黃酮得率的影響次序為C＞D＞A＞B，即超聲溫度＞料液比＞乙醇體積分數＞超聲時間。

表3 回歸方程方差分析

2.3.2 響應面法試驗設計

乙醇體積分數與超聲時間對黃酮得率影響的響應面圖見圖6，乙醇體積分數與超聲溫度對黃酮得率影響的響應面圖見圖7，乙醇體積分數與液料比對黃酮得率影響的響應面圖見圖8，超聲溫度與超聲時間對黃酮得率影響的響應面圖見圖9，超聲時間與料液比對黃酮得率影響的響應面圖見圖10，超聲溫度與料液比對黃酮得率影響的響應面圖見圖11。

圖6 乙醇體積分數與超聲時間對黃酮得率影響的響應面圖

圖7 乙醇體積分數與超聲溫度對黃酮得率影響的響應面圖

圖8 乙醇體積分數與料液比對黃酮得率影響的響應面圖

圖9 超聲溫度與超聲時間對黃酮得率影響的響應面圖

圖10 超聲時間與液料比對黃酮得率影響的響應面圖

交互效應的強弱趨向可以被響應面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反應，交互效應強弱水平可以從投影面的等高線形狀中觀察，曲面傾斜度越大，則該因素對響應值的影響越顯著。對比圖6～圖11，超聲溫度對秋椒葉黃酮得率的影響最大，液料比和乙醇體積分數次之，超聲時間的影響最小。各因素等高線橢圓形狀不明顯（圖6～11b），表明其交互作用不顯著，符合回歸方程的方差分析結果。

圖11 超聲溫度與液料比對黃酮得率影響的響應面圖

2.4 驗證試驗

經過響應面結果分析得到工藝條件的最優值分別為乙醇體積分數55.04%，超聲時間50.88 min，超聲溫度56.39℃，料液比1∶36.55（g∶mL），此時黃酮得率為25.858 8%。考慮實際操作的可行性及驗證結果的準確性，將工藝參數調整為乙醇體積分數55%，超聲時間50 min，超聲溫度56℃，料液比1∶36（g∶mL），在同等條件下進行3組重復試驗，得到秋椒葉總黃酮的得率為25.76%，與預測值接近（相對誤差為0.34%），說明響應面法優化秋椒葉總黃酮的提取工藝條件具有可行性。

3 結論

采用響應面法（RSM）優化了超聲輔助提取秋椒葉黃酮的工藝，建立了乙醇體積分數、超聲溫度、超聲時間和料液比對秋椒葉黃酮含量影響的回歸模型。結果表明，各因素對黃酮得率的影響次序為超聲溫度＞料液比＞乙醇體積分數＞超聲時間，由此得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分數55%，浸提時間50 min，浸提溫度56℃，料液比1∶36（g∶mL），在該條件下，大紅袍花椒葉中黃酮得率達到25.76%±0.05%。秋椒葉中總黃酮含量很高，黃酮具有非常好的研究價值和醫用價值，可進行更加深入的研究，提高秋椒葉的附加值，為花椒副產物的進一步開發利用提供理論參考。