苦蕎黃酮提取及分離純化工藝研究

徐 浪，梅 菊，王 玉，王 鵬，孫代華，石萬銀，劉源才，楊 強(qiáng)，童國強(qiáng)，陳志元

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435000；2.勁牌有限公司，湖北 黃石 435100）

苦蕎（Tartary buckwheat）學(xué)名韃靼蕎麥，別名萬年蕎、野蘭蕎、蕎葉七，隸屬于蓼科蕎麥屬（Fagopyrum tataricum Gaertn.），為一年生草本雙子葉植物，與“何首烏、大黃”等同屬蓼科，是我國藥食同源文化的典型體現(xiàn)，具有很高的食藥兩用價(jià)值[1]。蕎麥屬植物分為甜蕎和苦蕎2種，與普通蕎麥相比，苦蕎含有更多蘆丁、槲皮素、山奈酸、蕓香糖苷等黃酮類物質(zhì)[2-6]，這些具有生物活性成分的苦蕎黃酮對人體有抗氧化、清除氧自由基、降血糖、降血脂、改善認(rèn)知功能、抗高血壓和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，被譽(yù)為“三降食品” （降血糖、降血脂和降血壓），還具有抑菌、抗病毒、防癌、預(yù)防多種慢性疾病等功效[7-13]，在食品加工中廣泛用于各種糕點(diǎn)、調(diào)味品、保健品等生產(chǎn)中，深受人們喜愛[14-16]。提取工藝主要有乙醇浸提法、水煎煮法、超臨界萃取、微波提取、酶法提取、超聲提取等，分離純化工藝主要有大孔樹脂吸附、堿提酸沉和甲醇重結(jié)晶的方法[17-21]。

天然產(chǎn)物的化學(xué)成分十分復(fù)雜，通常含有多糖、黃酮、生物堿等有效成分，而傳統(tǒng)天然產(chǎn)物提取分離方法存在工藝復(fù)雜、分離效率低等不足，應(yīng)用膜分離技術(shù)可去除中藥提取物中的雜質(zhì)，并富集有效部位或有效成分[22]。反溶劑重結(jié)晶是利用結(jié)晶物在主溶劑與反溶劑中的溶解度差異對物質(zhì)重結(jié)晶的過程。主溶劑和反溶劑的種類選取是此技術(shù)的關(guān)鍵[23]。

以苦蕎麥為原料，利用正交試驗(yàn)考查苦蕎最佳提取工藝條件，并用孔徑為800 D和1 000 D的納濾膜對苦蕎提取液中的苦蕎黃酮進(jìn)行分離，去除分子量較大的雜質(zhì)，然后采用反溶劑結(jié)晶方法對苦蕎黃酮進(jìn)一步純化，得到純度較高的苦蕎黃酮提取物，試驗(yàn)過程不使用酸堿和有毒有害的有機(jī)溶劑，綠色無污染，適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麥，購自四川省西昌市；對照品蘆丁（HPLC 91.7%，UV 92.4%，批號100080-201811），中檢所提供；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

TU901型紫外-可見分光光度計(jì)，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；AB135-S型分析天平，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品產(chǎn)品；ELGA Option-Q型超純水系統(tǒng)；水浴鍋，上海申生科技有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品；膜過濾設(shè)備，濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液制備

取蘆丁對照品20 mg，精密稱量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取25 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL；加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在波長500 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 供試品溶液的制備

取本品25 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇適量，搖勻，超聲處理10 min，使其完全溶解，冷卻后定容，作為供試品溶液。

1.2.4 顯色測定

取供試品溶液，過濾，精密量取濾液2 mL，置于25 mL容量瓶中，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起，測定吸光度。

1.2.5 苦蕎黃酮檢測方法學(xué)研究

（1）線性范圍試驗(yàn)。精密稱取蘆丁對照品27.63 mg，按1.2.1的方法對照品溶液進(jìn)行制備，按1.2.2的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Abs=0.012 24C-0.002 6，R2=0.999 9。

（2）精密度試驗(yàn)。精密稱取苦蕎提取物樣品25.45 mg，按1.2.3的方法進(jìn)行供試品溶液制備，按1.2.4的方法顯色，于波長500 nm處比色測定，連續(xù)測定6次吸光度，由吸光度計(jì)算得到精密度試驗(yàn)的RSD值為0.070%。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。選擇精密度試驗(yàn)中樣品溶液，分別在0，5，10，15，20，25，30，60 min測定吸光度，由吸光度計(jì)算穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值為2.08%。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取苦蕎提取物樣品25 mg，采用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為溶劑，按照1.2.3的方法各制備6份供試品溶液作為重復(fù)性試驗(yàn)樣品，按1.2.4的方法顯色，于波長500 nm處比色測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到苦蕎提取物中總黃酮（以蘆丁計(jì)）含量平均值為73.05%，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為0.80%。

（5）加標(biāo)回收試驗(yàn)。精密稱定苦蕎提取物樣品9份，分別加入其所含總黃酮含量80%，100%，120%蘆丁對照品溶液（3 830.412 8 mg/L）各3份，搖勻，按1.2.3的方法制備供試品溶液，按1.2.4的方法進(jìn)行顯色，于波長500 nm處比色測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量和回收率。計(jì)算得到苦蕎提取物中蘆丁的平均回收率為102.02%，加標(biāo)回收試驗(yàn)的RSD值為2.06%。

1.2.6 苦蕎黃酮提取工藝研究

（1）單因素提取試驗(yàn)。①乙醇體積分?jǐn)?shù)的考查，準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，采用單因素試驗(yàn)，料液比選擇原料質(zhì)量的8倍體積，提取溫度選擇90℃，提取時(shí)間選擇2 h，提取次數(shù)2次，考查提取溶劑（30%乙醇，60%乙醇，80%乙醇，95%乙醇）對苦蕎黃酮提取率的影響。②提取溫度的考查，準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，采用單因素試驗(yàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇80%乙醇，料液比選擇8倍，提取時(shí)間選擇2 h，提取次數(shù)2次，考查提取溫度（水浴鍋加熱溫度60，70，80，90℃）對苦蕎黃酮提取率的影響。③料液比的考查，準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，采用單因素試驗(yàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度90℃，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次，考查料液比（4，8，12，16倍）對苦蕎黃酮提取率的影響。

（2）正交提取試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)方法，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時(shí)間4個(gè)因素對苦蕎黃酮提取率的影響，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，做L9（34）正交試驗(yàn)，提取次數(shù)為2次。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

（3）提取工藝驗(yàn)證。準(zhǔn)確稱取苦蕎麥100 g，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行3組平行提取試驗(yàn)，計(jì)算最佳提取工藝的苦蕎黃酮提取率，驗(yàn)證最佳提取工藝的穩(wěn)定性和合理性。

1.2.7 苦蕎黃酮膜分離試驗(yàn)

（1）提取液制備。稱取苦蕎麥1 000.0 g，根據(jù)最佳提取工藝進(jìn)行提取，收集提取液，并用硅藻土過濾機(jī)進(jìn)行粗濾。

（2）微濾。將上述粗濾后的苦蕎提取液用50 nm微濾膜進(jìn)行循環(huán)微濾，操作參數(shù)：流量1～2 L/h，溫度控制在30～35℃，操作壓力控制在0.5～0.6 MPa。截留液加入60%Vol乙醇繼續(xù)進(jìn)行微濾，直至透過液收集到過濾前等量體積為止。

（3）納濾。將上述微濾后的提取液，各取一半體積分別用孔徑為800 D和1 000 D的納濾膜進(jìn)行循環(huán)納濾，操作參數(shù)：流量1～2L/h，溫度控制在30～35℃，操作壓力控制在0.2～0.3 MPa。截留液加入60%Vol乙醇繼續(xù)進(jìn)行納濾，直至透過液收集到過濾前等量體積為止。

1.2.8 水沉純化苦蕎黃酮試驗(yàn)

將苦蕎800 D和1 000 D納濾膜過濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，并加水稀釋到5 000 mL進(jìn)行水沉，在4℃冰箱中靜置8 h后抽濾，濾餅干燥并進(jìn)行粉碎分別得到苦蕎黃酮粗提物。

1.2.9 反溶劑結(jié)晶純化苦蕎黃酮試驗(yàn)

（1）主溶劑對比試驗(yàn)。分別取2.0 g上述800 D納濾膜分離及水沉純化苦蕎黃酮提取物（苦蕎黃酮含量85.35%），分別加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇50 mL和無水甲醇溶解，然后分別緩慢加入到425 mL和450 mL純凈水中（調(diào)節(jié)乙醇和甲醇體積分?jǐn)?shù)到10%），邊加邊攪拌，然后于20℃下靜置結(jié)晶8 h，過濾，結(jié)晶沉淀干燥得苦蕎黃酮提取物。

（2）反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分?jǐn)?shù)對比試驗(yàn)。分別取3份2.0 g上述800分子量納濾膜分離及水沉純化苦蕎黃酮提取物（苦蕎黃酮含量85.35%），加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇50 mL，然后分別緩慢加入到425.0，187.5，108.3 mL純凈水中（分別調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，20%，30%），邊加邊攪拌，然后于20℃下靜置結(jié)晶8 h，過濾，結(jié)晶沉淀干燥得苦蕎黃酮提取物。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎黃酮檢測方法學(xué)研究

2.1.1 線性范圍試驗(yàn)

線性范圍試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明苦蕎中總黃酮的質(zhì)量濃度在0～49.231 2 m/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)的RSD值為0.070%，表明檢測結(jié)果的隨機(jī)誤差較小。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值為2.08%，表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。但由于試驗(yàn)過程中吸光度呈下降趨勢，所以建議供試品溶液顯色后應(yīng)在20 min內(nèi)測試完成。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

苦蕎提取物中總黃酮（以蘆丁計(jì)）含量為73.05%，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為0.80%，表明檢測結(jié)果重復(fù)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

苦蕎提取物中蘆丁對照品溶液的回收率在99.41%～105.90%，平均值為102.02%，RSD值為2.06%。表明該檢測方法檢測苦蕎提取物中總黃酮的含量準(zhǔn)確可靠。

2.2 提取工藝

2.2.1 單因素提取試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)的考查。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦蕎黃酮提取率的影響，60%乙醇提取的苦蕎黃酮提取率最高。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的考查見表2。

表2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的考查

（2）提取溫度的考查。不同提取溫度對苦蕎黃酮提取率的影響，提取溫度越高，苦蕎黃酮提取率越高，但80℃與90℃相比提取率基本無差異。

不同提取溫度的考查見表3。

表3 不同提取溫度的考查

（3）料液比的考查。不同料液比對苦蕎黃酮提取率的影響，料液比對苦蕎黃酮提取率影響較小。

不同料液比的考查見表4。

表4 不同料液比的考查

2.2.2 正交提取試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，最佳的提取工藝條件為A2B3C2D2，由極差值可知各因素對苦蕎黃酮提取率的影響次序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞提取溫度（B）＞提取時(shí)間（D）＞料液比（C）。其中，料液比和提取時(shí)間影響很小，從成本和生產(chǎn)效率的角度考慮，選擇4倍量，因此確定苦蕎麥提取工藝為4倍量60%乙醇，80℃提取2h，提取2次。

2.2.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

最佳提取正交工藝驗(yàn)證試驗(yàn)見表6。

表6 最佳提取正交工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由表6可知，3組驗(yàn)證試驗(yàn)的苦蕎黃酮提取率RSD值為0.65%，說明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

表6 驗(yàn)證結(jié)果

2.3 膜分離試驗(yàn)

檢測各步驟苦蕎黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算苦蕎黃酮在膜過濾過程中的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明，苦蕎黃酮在微濾過程中損失較少，800D和1000D納濾過程黃酮轉(zhuǎn)移率分別為94.53%和94.64%，損失也比較少。

膜過濾試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 膜過濾試驗(yàn)結(jié)果

2.4 水沉純化試驗(yàn)

將800，1000D納濾膜過濾液回收乙醇并進(jìn)行水沉分別得苦蕎黃酮粗提物11.77g和11.86g，測定提取物中苦蕎黃酮含量分別為85.35%和83.29%。

2.5 反溶劑結(jié)晶純化試驗(yàn)

2.5.1 主溶劑對比試驗(yàn)

主溶劑對比試驗(yàn)見表8。

表8 主溶劑對比試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，以乙醇和甲醇作為主溶劑進(jìn)行反溶劑結(jié)晶的試驗(yàn)結(jié)果基本無差異，但乙醇與甲醇相比，綠色無污染，且成本低，更適于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，因此選擇用乙醇作為主溶劑進(jìn)行反溶劑結(jié)晶純化。

2.5.2 反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分?jǐn)?shù)對比試驗(yàn)

對反溶劑重結(jié)晶的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考查試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同體積分?jǐn)?shù)的苦蕎黃酮質(zhì)量濃度和提取率差異不大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，苦蕎黃酮含量略有升高，而提取率有所下降。綜合考慮，20%乙醇體積分?jǐn)?shù)最佳。

反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分?jǐn)?shù)對比試驗(yàn)見表9。

表9 反溶劑重結(jié)晶乙醇體積分?jǐn)?shù)對比試驗(yàn)

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)結(jié)果確定了苦蕎最佳提取工藝為4倍量60%乙醇，80℃提取2h，提取2次。提取驗(yàn)證試驗(yàn)表明該工藝條件穩(wěn)定可行。

苦蕎黃酮主要為蘆丁、槲皮素、山奈酚等成分，分子量分別為610.51，302.00，286.23，其中蘆丁占比90%左右。因此，試驗(yàn)選擇800D和1000D納濾膜進(jìn)行苦蕎提取液的過濾分離，去除分子量較大的雜質(zhì)，起到純化苦蕎黃酮的目的。

蘆丁、槲皮素等黃酮類成分難溶于水，因此對經(jīng)過膜分離的苦蕎提取液進(jìn)行濃縮回收乙醇后進(jìn)行水沉析出苦蕎黃酮沉淀，通過過濾去除水溶性雜質(zhì)，從而對苦蕎黃酮進(jìn)行純化。

利用苦蕎黃酮在甲醇、乙醇與水中的溶解度差異，進(jìn)行反溶劑結(jié)晶，可進(jìn)一步對苦蕎黃酮進(jìn)行純化。試驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇和乙醇作為主溶劑的試驗(yàn)結(jié)果基本無差異，且乙醇綠色無污染、成本低，更適于大規(guī)模生產(chǎn)。同時(shí)，對比不同乙醇體積分?jǐn)?shù)反溶劑結(jié)晶試驗(yàn)結(jié)果，20%乙醇體積分?jǐn)?shù)最佳。參考文獻(xiàn)：

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