鋅脅迫下大葉落地生根富集規(guī)律及生理響應(yīng)

黃廣振 程亞平 黃月群 李煜鑫 覃瑩璐

(桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541006)

引言

鋅(Zn)是植物體內(nèi)必需的微量元素之一，具有重要的生理功能和營(yíng)養(yǎng)作用。鋅可以作為6大類功能酶中不同的輔助因子成分，可以調(diào)節(jié)酶的活性[1]。

低濃度鋅對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，當(dāng)鋅元素及其化合物大量進(jìn)入環(huán)境，使環(huán)境中的鋅元素超過植物正常生長(zhǎng)的需要，超過一定濃度就會(huì)產(chǎn)生毒害作用。鋅可以直接影響植物的生理代謝，高濃度鋅會(huì)對(duì)植物根系產(chǎn)生損害，進(jìn)而影響植物對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收，影響植物的正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植物死亡[2]。有研究表明，鋅是植物中2種染色蛋白質(zhì)蛋白的必需元素，鋅通過調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白來控制遺傳物質(zhì)的活動(dòng)，進(jìn)而影響植物體內(nèi)的DNA和RNA[3]。

當(dāng)環(huán)境中鋅超標(biāo)時(shí)，植物修復(fù)是一種很有前景、相對(duì)簡(jiǎn)單高效的替代方法，且植物修復(fù)不會(huì)造成二次污染。植物修復(fù)存在一些不足，如植株成本過高、生物量過小等，因而需要綜合考慮選取修復(fù)的植物，如除了考慮植物對(duì)鋅富集外，仍然需要考慮成本、總體富集量等。當(dāng)植物對(duì)某種金屬有較好富集能力時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)植物耐受性較差，生長(zhǎng)緩慢，生物量較低，成本較高，就不適合做修復(fù)。故在選取植物修復(fù)時(shí)，需要研究該植物對(duì)重金屬的富集能力以及耐受性。

本次實(shí)驗(yàn)植物為大葉落地生根，是景天科伽藍(lán)菜屬多年生肉質(zhì)草本植物，不定芽入土即可形成新的植株，故名“落地生根”，原產(chǎn)于非洲馬達(dá)加斯加，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[4]。景天科植物對(duì)重金屬有較好吸收效果，如東南景天，是鋅(Zn)、鎘(Cd)、鉛(Pb)的超富集植物[5-7]，伴礦景天是鋅(Zn)、鎘(Cd)超富集植物[8]，大葉落地生根植物具無性繁殖的優(yōu)勢(shì)，屬于研究高等植物無性繁殖的模式植物，大葉落地生根葉緣凹陷處會(huì)形成可進(jìn)行無性繁殖的不定芽[9,10]，不定芽自然脫落后到土里，便可自然生長(zhǎng)。

該植物無性繁殖的特點(diǎn)使得在植物修復(fù)成本上有巨大優(yōu)勢(shì)，且目前缺少關(guān)于大葉落地生根植物對(duì)鋅富集及脅迫作用的研究，為彌補(bǔ)這方面空白，本論文以水培大葉落地生根為例，研究其對(duì)鋅的富集效果，植物體主要富集的部位以及不同濃度、不同時(shí)間下葉綠素、類胡蘿卜素和丙二醛(MDA)含量的變化，初步探索大葉落地生根對(duì)鋅的富集規(guī)律及耐受性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 大地落葉生根

選取人工培育、長(zhǎng)勢(shì)一致的大葉落地生根幼苗，將幼苗用超純水清洗，置于陰涼處晾2～3d，置于水中培養(yǎng)7d后，待取用。

1.1.2 溶液培養(yǎng)

營(yíng)養(yǎng)液成分：硝酸鈣(CaNO3)472.5mg·L-1、硝酸鉀(KNO3)303.5mg·L-1、磷酸銨(Mg3(PO4)2)57.5mg·L-1、硫酸鎂(MgSO4)246.5mg·L-1、鐵鹽溶液2.5mL·L-1。

培養(yǎng)液中鋅含量設(shè)計(jì)組濃度為10mg·L-1、30mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1以及0mg·L-1的對(duì)照組，培養(yǎng)瓶選取50mL直口錐形瓶，每個(gè)濃度設(shè)置4組，每隔15d測(cè)定植物體內(nèi)的鋅含量，以及葉綠素、類胡蘿卜素和丙二醛(MDA)含量。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 鋅

鋅的測(cè)定方法采用硝酸—雙氧水消解方法，采集植物，用去離子水清洗3遍，烘干處理，稱取一定重量(0.1g左右)，加熱板敞口消解，消解至澄清剩1mL左右，定容至15mL，采用ICP(Opetma 7000DV型電感耦合等離子光譜發(fā)生儀)測(cè)定。

1.2.2 葉綠素、類胡蘿卜素

測(cè)定葉綠素、類胡蘿卜素方法[11]：取不同濃度下處理的葉片0.1g剪碎后放入研缽，加入10mL體積比為95%的無水乙醇，研磨，過濾，最后用3000rpm離心10min。離心后所得上清液在分光光度計(jì)上依次采用665nm、649nm和470nm 3個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。

1.2.3 丙二醛

丙二醛測(cè)定方法[12]：取0.5g植物樣品，先加10%TCA 2mL研磨勻漿后再加入3mL TCA進(jìn)一步研磨，研磨后所得勻漿在3000r·min-1下離心10min，上清液為樣品提取液。取上述步驟所得的上清液2.0mL于帶塞試管中，加入0.5% TBA溶液2.0mL，混合后于沸水浴上反應(yīng)20min,迅速冷卻后離心，上清液分別于532nm、600nm及450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。對(duì)照管以2mL水代替提取液。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉落地生根對(duì)鋅富集規(guī)律

根據(jù)植物體根部鋅含量變化情況，見圖1，植物根部鋅含量最大值是在100mg·L-1濃度培養(yǎng)下第60天為1167.10mg·kg-1；植物根部鋅含量最小值是在10mg·L-1濃度培養(yǎng)下第15天為90.56mg·kg-1。從根部對(duì)鋅富集量來分析，根部鋅富集量隨鋅濃度增大而增加。

根據(jù)植物體莖部鋅含量變化情況，見圖2，植物莖部鋅含量最大值是在100mg·L-1濃度培養(yǎng)下第60天為558.0mg·kg-1；植物莖部鋅含量最小值是在10mg·L-1濃度培養(yǎng)下第15天為53.06mg·kg-1。從同一培養(yǎng)濃度條件下，莖部鋅含量隨時(shí)間而增大。從同樣培養(yǎng)天數(shù)條件下，莖部鋅含量與培養(yǎng)濃度正相關(guān)。斜率逐漸減少，說明隨著富集速率減小。100mg·kg-1培養(yǎng)條件下的富集量最高。

根據(jù)植物體葉部鋅含量變化情況，見圖3，植物葉部鋅含量最大值是在100mg·L-1濃度培養(yǎng)下第60天為618.92mg·kg-1；植物葉部鋅含量最小值是在10mg·L-1濃度培養(yǎng)下第15天為31.8mg·kg-1。從葉部對(duì)鋅富集量來分析，葉部鋅富集量隨鋅濃度增大而增加。

莖葉中鋅含量與根部鋅含量比值代表了鋅在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的強(qiáng)弱，由圖4可知，在第15天時(shí)4個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組比值均小于0.5，在第30天和第45天時(shí)實(shí)驗(yàn)組10mg·L-1和30mg·L-1比值大于0.5，在第60天時(shí)4個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組比值均大于0.5。從4個(gè)實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間轉(zhuǎn)移比值分析，短時(shí)間內(nèi)低濃度大葉落地生根植物體內(nèi)具有一定轉(zhuǎn)移能力，超過一定時(shí)間低濃度和高濃度比值均大于0.5，說明即使在較高鋅濃度下，植物體對(duì)鋅依然具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。

圖1 植物根部鋅含量

圖2 植物莖部鋅含量

圖3 植物葉片鋅含量

圖4 Zn(莖葉)與Zn(根)比值

2.2 植物葉綠素含量和類胡蘿卜素變化

在培養(yǎng)液培養(yǎng)下，實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組葉綠素變化趨勢(shì)是逐漸上升，見圖5。最大值是在培養(yǎng)至第30天時(shí)為5.44mg·L-1，最小值是在培養(yǎng)至第15天時(shí)為4.97mg·L-1。從4個(gè)時(shí)間對(duì)照組葉綠素含量變化來看，說明培養(yǎng)液能滿足植物正常生理活動(dòng)所需，因而植物在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)旺盛。

在含鋅培養(yǎng)液培養(yǎng)下，實(shí)驗(yàn)組10mg·L-1和30mg·L-1葉綠素變化趨勢(shì)是先上升后逐漸下降；實(shí)驗(yàn)組50mg·L-1和100mg·L-1葉綠素變化趨勢(shì)是先下降后逐漸上升。實(shí)驗(yàn)組最大值是在10mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為5.40mg·L-1，最小值是在100mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為3.34mg·L-1。

實(shí)驗(yàn)組10mg·L-1和30mg·L-1在第15～30天時(shí)葉綠素含量上升，且高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組50mg·L-1和100mg·L-1而在第15～30天時(shí)葉綠素含量下降，說明在較低鋅濃度一定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)對(duì)植物葉綠素有促進(jìn)作用，超過一定濃度時(shí)會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

通過對(duì)葉綠素與培養(yǎng)濃度做線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)葉綠素與培養(yǎng)濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，判定系數(shù)均大于0.7。說明總體趨勢(shì)上隨著鋅濃度增加對(duì)葉綠素產(chǎn)生起抑制作用(第15天時(shí)：y=-0.010+5.201，R2=0.7717；第30天時(shí)：y=-0.0215+5.409，R2=0.7692；第45天時(shí)：y=-0.0193+5.256，R2=0.9464；第60天時(shí)：y=-0.0179+5.263，R2=0.9436)。

經(jīng)過計(jì)算，葉綠素a和葉綠素b變化趨勢(shì)與葉綠素較為一致，空白對(duì)照組葉綠素a和葉綠素b變化均隨時(shí)間逐漸升高，實(shí)驗(yàn)組10mg·L-1和30mg·L-1的葉綠素a和葉綠素b變化趨勢(shì)是先上升后逐漸下降；實(shí)驗(yàn)組50mg·L-1和100mg·L-1葉綠素a和葉綠素b變化趨勢(shì)是先下降后逐漸上升。

對(duì)照組葉綠素a最大值是在培養(yǎng)至第60天時(shí)為4.04mg·L-1，最小值是在培養(yǎng)第15天時(shí)為3.76mg·L-1。對(duì)照組葉綠素b最大值是在培養(yǎng)至第60天時(shí)為1.40mg·L-1，最小值是在培養(yǎng)第15天時(shí)為1.21mg·L-1。實(shí)驗(yàn)組葉綠素a最大值是在10mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為3.96mg·L-1，最小值是在100mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為2.53mg·L-1。實(shí)驗(yàn)組葉綠素b最大值是在10mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為1.45mg·L-1，最小值是在100mg·L-1濃度下培養(yǎng)第45天時(shí)濃度為0.75mg·L-1。

在鋅溶液培養(yǎng)下，植物葉片類胡蘿卜素含量變化與葉綠素含量變化趨勢(shì)上較為一致，見圖6。實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組類胡蘿卜素最大值是在培養(yǎng)至第60天時(shí)為1.29mg·L-1，最小值是在培養(yǎng)第15天時(shí)為1.14mg·L-1。實(shí)驗(yàn)組葉綠素最大值是在30mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為1.38mg·L-1，最小值是在100mg·L-1濃度下培養(yǎng)第30天時(shí)濃度為0.86mg·L-1。

通過對(duì)類胡蘿卜素與培養(yǎng)濃度做線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素與培養(yǎng)濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，判定系數(shù)均大于0.6(第15天時(shí)：y=-0.003+1.228，R2=0.7267；第30天時(shí)：y=-0.005+1.369，R2=0.6737；第45天時(shí)：y=-0.004+1.312，R2=0.9508；第60天時(shí)：y=-0.003+1.241，R2=0.83928)。

圖5 葉綠素含量

圖6 類胡蘿卜素

2.3 植物丙二醛含量變化

空白對(duì)照組植物葉片丙二醛含量變化呈逐漸下降趨勢(shì)，見圖7，說明培養(yǎng)液未對(duì)植物產(chǎn)生脅迫。對(duì)照組丙二醛含量最大值在培養(yǎng)第15天時(shí)濃度為2.53nmol·g-1，最小值在培養(yǎng)60天時(shí)濃度為2.29nmol·g-1。

實(shí)驗(yàn)組10mg·L-1和30mg·L-1的丙二醛變化趨勢(shì)是先上升后逐漸下降；實(shí)驗(yàn)組50mg·L-1和100mg·L-1丙二醛變化趨勢(shì)是先下降后逐漸上升。實(shí)驗(yàn)組丙二醛含量最大值在100mg·L-1培養(yǎng)下第30天時(shí)濃度為4.58nmol·g-1，最小值在10mg·L-1培養(yǎng)下第15天時(shí)濃度為3.27nmol·g-1。

通過對(duì)丙二醛含量與培養(yǎng)濃度做線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)葉綠素與培養(yǎng)濃度呈正相關(guān)關(guān)系，判定系數(shù)均大于0.8。說明隨著鋅濃度增加對(duì)丙二醛產(chǎn)生起促進(jìn)作用(第15天時(shí)：y=0.013+2.32，R2=0.8203；第30天時(shí)：y=0.024+2.156，R2=0.8369；第45天時(shí)：y=0.227+2.201，R2=0.9339；第60天時(shí)：y=0.019+2.445，R2=0.9612)。

圖7 丙二醛含量變化

3 討論

大葉落地生根植物對(duì)鋅富集情況，植物富集鋅的部位主要集中在根部。莖和葉則培養(yǎng)條件不同富集情況也不同，植物在第15天和第30天時(shí)莖中鋅含量大于葉中鋅含量；植物在第45天和第60天時(shí)葉中鋅含量大于莖中鋅含量；說明鋅從莖遷移到葉中遷移速度慢，需要足夠的時(shí)間，但具有一定的遷移能力。在10mg·L-1和30mg·L-1較低濃度培養(yǎng)時(shí)，Zn(莖葉)與Zn(根)比值大于0.5，此時(shí)植物對(duì)鋅的遷移能力較強(qiáng)?？傻?，植物對(duì)鋅在一定條件下，對(duì)鋅的遷移能力較強(qiáng)。

葉綠素是表明光合作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)，本次實(shí)驗(yàn)葉綠素含量變化有2種情況，10mg·L-1和30mg·L-1實(shí)驗(yàn)組在第15天和第30天時(shí)葉綠素高于對(duì)照組，說明較低濃度鋅對(duì)植物葉綠素合成有促進(jìn)作用。在第45天和第60天時(shí)葉綠素低于對(duì)照組，隨著時(shí)間積累也會(huì)對(duì)植物造成抑制。50mg·L-1和100mg·L-1實(shí)驗(yàn)組在第15天和第30天時(shí)葉綠素呈下降趨勢(shì)，說明較高濃度鋅對(duì)植物抑制作用。在第45天和第60天時(shí)葉綠素緩慢上升，說明植物在較高濃度鋅中具有調(diào)節(jié)能力，不利環(huán)境中具有一定的抗逆性。

類胡蘿卜素作用是接受過剩的激發(fā)態(tài)葉綠素分子的能量，從而避免形成單線態(tài)氧，起到一種光保護(hù)作用[13,14]，本次實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組類胡蘿卜素逐漸上升，10mg·L-1和30mg·L-1實(shí)驗(yàn)組類胡蘿卜素含量隨時(shí)間先上升后下降，30mg·L-1和50mg·L-1實(shí)驗(yàn)組類胡蘿卜素含量隨時(shí)間先下降后上升。在變化趨勢(shì)上與葉綠素變化較為一致，符合理論預(yù)期結(jié)果。

丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，代表對(duì)植物體脅迫作用越大丙二醛合成就越多。本次實(shí)驗(yàn)丙二醛含量變化，對(duì)照組丙二醛含量逐漸下降；10mg·L-1和30mg·L-1實(shí)驗(yàn)組丙二醛含量先下降后升高；50mg·L-1和100mg·L-1實(shí)驗(yàn)組丙二醛含量先上升后下降，此時(shí)說明植物在較高鋅濃度時(shí)具有一定抗逆性。丙二醛含量變化與葉綠素含量相反，符合預(yù)期理論結(jié)果。

4 結(jié)論

在鋅濃度10mg·L-1、30mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1以及空白對(duì)照等水培條件下的結(jié)果主要有以下幾點(diǎn)。

植物體在根、莖和葉中鋅的最大含量分別為1167.10mg·kg-1、558.00mg·kg-1、618.92mg·kg-1。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得根系中鋅的富集含量最高，植物體內(nèi)富集含量大小順序有2種情況：根>莖>葉；根>葉>莖。

植物莖葉鋅含量與根部鋅含量比值均小于1，但在第60天時(shí)各濃度組均大于0.5，說明植物在足夠時(shí)間培養(yǎng)下，植物對(duì)鋅有一定轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

葉綠素含量、類胡蘿卜含量與培養(yǎng)液鋅濃度總體變化上是負(fù)相關(guān)關(guān)系；丙二醛含量與培養(yǎng)液鋅濃度總體變化上是正相關(guān)關(guān)系；實(shí)驗(yàn)組10mg·L-1和30mg·L-1前期葉綠素高于對(duì)照組，說明較低鋅濃度在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)植物生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，較高鋅濃度抑制植物的正常生理活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組50mg·L-1和100mg·L-1葉綠素先降低后上升，說明在較高鋅濃度時(shí)具有一定抗逆性。