多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LAMC2是調(diào)節(jié)泛癌微環(huán)境的關(guān)鍵因子

蘇路瑛，黃 容，鄒定峰，許 富，李 凱，盧 艷，繆時(shí)英，王琳芳，宋 偉

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

層黏連蛋白γ2(γ2 laminin, gamma 2，LAMC2)與其他兩條鏈一起組成了多黏連蛋白-332。LAMC2位于染色體1q25-q31上[1]。LAMC2作為一個(gè)配體蛋白，它通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境與其幾個(gè)細(xì)胞表面受體ITGA3(integrin subunit alpha 3)、ITGA6(integrin subunit alpha 6)、ITGB1(β1-integrin)、ITGB4(integrin subunit beta 4)、ITGA2(integrin subunit alpha 2)、CD151(CD151 antigen)、COL17A1(collagen type ⅩⅦ alpha 1 Chain)的相互作用來驅(qū)動腫瘤發(fā)生。它可能作為抑制腫瘤發(fā)生的潛在抗癌治療靶點(diǎn)。LAMC2高表達(dá)往往與人類腫瘤的總生存率差、早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。它會影響正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的分化、遷移和黏附，以及表型和存活[2-4]。并且LAMC2可能作為侵襲性腫瘤的特異性標(biāo)志物[2, 5]。

盡管研究顯示，LAMC2在多種腫瘤中均有促癌的作用。但仍缺乏泛癌相關(guān)分析。因此，本研究運(yùn)用多種數(shù)據(jù)庫對LAMC2的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析，利用多組學(xué)數(shù)據(jù)證明LAMC2是影響患者腫瘤發(fā)生和臨床預(yù)后的關(guān)鍵分子，也是泛癌微環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)控因子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象：將2018年9月1日至2020年12月31日就診于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院肝膽外科的4例胰腺癌患者作為本次研究對象，本課題入組患者的入選均為病理確診為胰腺癌患者，簽署知情同意書并接受手術(shù)治療。年齡在48～75(63.72±7.27)歲。 本研究通過經(jīng)國家腫瘤中心/腫瘤醫(yī)院倫理委員會、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院審核(21/197-2868號)。

1.1.2 主要試劑：自發(fā)熒光淬滅劑、488山羊抗小鼠熒光二抗、CY3標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗、含DAPI封片劑(均Servicebio公司)，LAMC2一抗(Abcam公司)，CD151一抗(Immunoway公司)。

1.2 方法

1.2.1 LAMC2表達(dá)的泛癌分析：使用TCGA門戶網(wǎng)站GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)[6]。使用GEPIA2獲取TCGA的32種腫瘤類型的RNAseq測序數(shù)據(jù)和配套的臨床信息，進(jìn)行不同癌組織與癌旁組織差異基因的分析，并且根據(jù)腫瘤分期、分級、患者種族、體質(zhì)量及其他各種臨床病理特征分組，依據(jù)分組計(jì)算LAMC2基因表達(dá)量。所有的表達(dá)量數(shù)據(jù)都進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，并以每個(gè)數(shù)組的中位數(shù)為中心，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差歸一化。圖中紅色代表腫瘤樣本LAMC2的RNA表達(dá)量，藍(lán)色代表正常樣本LAMC2的RNA表達(dá)量。

1.2.2 LAMC2在腫瘤單細(xì)胞測序中的表達(dá)研究：單細(xì)胞測序技術(shù)通常用來解析腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞組分與互作情況，從而篩選出腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)。因此使用TISCH(http://tisch.comp-genomics.org/)分析不同腫瘤單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)[7]。挖掘LAMC2在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的主要表達(dá)細(xì)胞群及表達(dá)量并進(jìn)行可視化。在UMAP圖中用灰色至藍(lán)色表示每個(gè)細(xì)胞LAMC2的表達(dá)量。

1.2.3 LAMC2的細(xì)胞表達(dá)位置分析：使用Reactome、Ensembl、Gene Ontology分析LAMC2在細(xì)胞上的表達(dá)位置，并使用swissbiopics(https://www.swissbiopics. org)在線作圖工具作圖。

1.2.4 LAMC2蛋白表達(dá)量：使用HPA(human protein atlas)(https://www.proteinatlas.org)數(shù)據(jù)庫檢索LAMC2在各種腫瘤組織及正常組織中亞細(xì)胞中定位、在各組織中的表達(dá)情況以及免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色結(jié)果。使用Prism 7 formac軟件(SanDiego，CA，USA)對數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤組織IHC陽性程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 LAMC2蛋白組學(xué)表達(dá)數(shù)據(jù)：登錄到交互式網(wǎng)絡(luò)資源UALCAN門戶網(wǎng)站( http：//ualcan.path. uab. edu/analysis-prot.html)[8]，并應(yīng)用“CPTAC分析”模塊研究蛋白表達(dá)水平。在每個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)譜中，CPTAC數(shù)據(jù)庫將記錄的表達(dá)值歸一化到與中位數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。通過檢索“LAMC2”,比較腫瘤和正常組織中LAMC2總表達(dá)水平。選取10種腫瘤的現(xiàn)有數(shù)據(jù)集，包括卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、肺腺癌和胰腺癌等。

1.2.6 LAMC2胰腺癌組織石蠟切片免疫熒光：提前一晚將石蠟切片放置于50 ℃烘箱中，讓石蠟融化后將胰腺癌石蠟切片梯度脫蠟。隨后組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸(EDTA)(pH=8.0)抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)15 min。待玻片自然冷卻，將玻片洗滌后用組化筆在組織周圍畫圈，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，并用流水沖洗。在組畫筆圈內(nèi)滴加5%的牛血清白蛋白(BSA)，于室溫封閉30 min。使用PBS緩沖液(pH=7.4)將LAMC2抗體按1∶200稀釋，LAMC2的受體CD151按1∶100稀釋。滴加抗體至玻片上，4 ℃孵育過夜。玻片洗滌甩干后在圈內(nèi)滴加一滴按1∶500配制的488山羊抗鼠與594山羊抗兔熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育60 min后洗滌。最后玻片用含DAPI的封片劑封片，蓋上蓋玻片。待玻片干透后，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 腫瘤免疫微環(huán)境分析：使用TIMER(https:// cistrome.shinyapps.io/timer/)進(jìn)行不同腫瘤的LAMC2表達(dá)量與免疫細(xì)胞組分浸潤分析[9]。

2 結(jié)果

2.1 LAMC2的RNA表達(dá)情況

分析LAMC2在TCGA不同腫瘤類型癌組織與正常組織中的表達(dá)量(圖1)。LAMC2在大多數(shù)腫瘤組織中的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，其中包括膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)，宮頸鱗癌和腺癌(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC)，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC)，結(jié)腸癌(colon adenocarcinoma，COAD)，食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)，頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)，腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)，肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)，肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)，卵巢漿液性囊腺瘤(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)，胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)， 前列腺癌(prostate adenocar-cinoma，PRAD)，直腸腺癌(rectum adenocarcinoma，READ)，胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)，睪丸生殖細(xì)胞癌(testicular germ cell tumors，TGCT)，甲狀腺癌(thyroid carcinoma，THCA)，胸腺瘤(thymoma，THYM)，子宮體內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)，子宮癌肉瘤(uterine carcinosarcoma，UCS)。只有在腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe，KICH)，腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)，皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)這3種腫瘤中與相鄰的正常組織相比，LAMC2在腫瘤的表達(dá)量顯著低于正常組織(P<0.05)。

Dotplot of genes expression in different tissue; tumor names in red indicate high gene expression; tumor names in green indicate low gene expression

熱圖表示每種腫瘤組織中LAMC2的表達(dá)量(圖2A)，紅色越深，代表表達(dá)量越高。其中，在基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma,BCC)，膽管癌(cholangiocarcinoma,CHOL)，結(jié)腸癌(colon cancer,CRC)，頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)，非小細(xì)胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)，胰腺癌(pancreatic adenocar-cinoma，PAAD)中主要在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。單獨(dú)選用這幾種腫瘤進(jìn)行分群(圖2B)，其中藍(lán)色越深代表LAMC2表達(dá)量越高。結(jié)合Bulk RNA-seq與單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)LAMC2在結(jié)腸癌(CRC)、膽管癌(CHOL)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)、卵巢癌(OV)和胰腺癌(PAAD)中是一個(gè)與腫瘤惡性潛在相關(guān)的基因。

2.2 LAMC2的蛋白表達(dá)情況

觀察到LAMC2既可作為分泌蛋白，也可作為膜蛋白，它分布在細(xì)胞的胞外區(qū)域或基底膜，細(xì)胞膜等位置上(圖3A)。

檢測了數(shù)據(jù)庫中44例正常組織的LAMC2蛋白表達(dá)(圖3B)。LAMC2蛋白在闌尾、乳房、支氣管、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜、輸卵管、鼻咽、扁桃體中均有中等水平表達(dá)，但在腎上腺、骨髓、尾狀、小腦、大腦皮層、子宮頸、十二指腸、附睪、食道、膽囊、心肌、海馬體、腎臟、肝、肺、淋巴結(jié)、口腔黏膜、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、胎盤、前列腺癌、直腸、精囊、皮膚、小腸、平滑肌、軟組織、脾、胃、睪丸和陰道中均未見表達(dá)。

A.LAMC2 expression in single cell sequencing data of human pan-carcinomatous tissues; B.expression of LAMC2 in single cell sequencing data of several human cancer tissues

A.expression of LAMC2 in human cells; B.expression intensity of LAMC2 protein in normal human tissues; C.LAMC2 protein expression ratio in human tumor tissues

LAMC2蛋白在大多數(shù)胰腺癌、皮膚癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、移行細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌患者中表達(dá)。在前列腺癌、睪丸癌、良性腫瘤、肝癌、乳腺癌中均觀察到弱至中度的細(xì)胞質(zhì)免疫反應(yīng)性(圖3C)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、黑素瘤、淋巴瘤組織中均呈陰性染色。根據(jù)HPA數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學(xué)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)胰腺癌與皮膚癌在癌組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于癌旁的表達(dá)量(圖4A,B)。選用了4例胰腺癌患者的胰腺癌組織石蠟切片進(jìn)行免疫熒光染色驗(yàn)證其在胰腺癌上的表達(dá)水平(圖4C)，其中綠色為LAMC2,紅色為LAMC2的受體CD151，藍(lán)色為DAPI。

最后，蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與正常組織相比，原發(fā)性乳腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌和頭頸癌中總蛋白的表達(dá)水平增強(qiáng)(圖4D)。

2.3 多種腫瘤中LAMC2表達(dá)量與預(yù)后的關(guān)系

對TCGA中所有種類的腫瘤患者的預(yù)后進(jìn)行了總生存期(overall survival,OS)分析。LAMC2高表達(dá)水平與較差的OS相關(guān)(圖5)。

2.4 LAMC2與免疫浸潤

腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的主要組成部分，對腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展或轉(zhuǎn)移均有重要作用。因此，評估各種腫瘤中LAMC2基因表達(dá)與不同免疫細(xì)胞浸潤水平之間的潛在相關(guān)性(圖6)。通過研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌(COAD)、前列腺癌(PRAD)和直腸腺癌(READ)中觀察到LAMC2表達(dá)水平與浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞水平呈正相關(guān)(rCOAD=0.258，rPRAD=0.216，rREAD=0.401，P<0.05) 。在結(jié)腸癌(COAD)，前列腺癌(PRAD)，甲狀腺癌(THCA)中與CD4+T細(xì)胞水平呈正相關(guān) (rCOAD=0.281，rPRAD=0.1，rTHCA=0.568，P<0.05)。并且這幾種腫瘤也與其他免疫細(xì)胞例如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞水平相關(guān)。從分析中可以看出，LAMC2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性模式在不同的腫瘤中明顯不同。因此LAMC2可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的成分和免疫機(jī)制來影響抗腫瘤免疫。

A.expression intensity of LAMC2 protein in human tumor tissuesdatabase was measured by immunohistochemistry staining; B.immunohistochemistry of LAMC2 in several human tumortissuesand corresponding normal tissues; C. immunohistochemistry of LAMC2 in several human neoplasms and corresponding normal tissues; D. proteomics data of LAMC2 in several human tumor tissues and corresponding normal tissues

3 討論

目前，腫瘤仍是全球范圍內(nèi)重要的公共健康安全問題，治療方式主要以手術(shù)、化療、放療以及藥物為主。目前提倡個(gè)體化精準(zhǔn)治療，從而研發(fā)了很多分子靶向藥物，分子靶向藥物有療效顯著，副作用小等優(yōu)點(diǎn)。但是腫瘤異質(zhì)性極大制約著腫瘤精準(zhǔn)治療。腫瘤異質(zhì)性內(nèi)在體現(xiàn)為分子表達(dá)譜的差異，外在表現(xiàn)為患者預(yù)后、復(fù)發(fā)等區(qū)別。目前腫瘤的精準(zhǔn)治療由于存在腫瘤異質(zhì)性問題，導(dǎo)致很多分子靶向藥療效個(gè)體差異較大，所以急需找到一個(gè)在患癌人群中廣泛適用的靶向藥物靶點(diǎn)。

圖5 LAMC2的表達(dá)與泛癌患者總生存期(OS)的相關(guān)性Fig 5 Correlation between LAMC2 expression and overallsurvival(OS) in patients with generalized carcinoma

以往文獻(xiàn)報(bào)道LAMC2在多種肝細(xì)胞癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)[2]。并且證明了LAMC2蛋白在胰腺、胃、舌、膀胱、陰道、宮頸、結(jié)直腸癌、肺癌、食管鱗癌以及黑色素瘤和間變性甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)中高表達(dá)[2]。本文通過TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘LAMC2的Bulk RNA-seq的RNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，LAMC2的RNA在多數(shù)腫瘤中表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，并且通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)解析了LAMC2在多種腫瘤中表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞。因此推測LAMC2是與腫瘤惡性相關(guān)的基因。通過腫瘤免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析LAMC2的蛋白表達(dá)水平，證明其在多種腫瘤中表達(dá)量高于癌旁組織。并通過實(shí)驗(yàn)證明LAMC2在胰腺癌微環(huán)境中與其受體一起發(fā)揮作用。

另外， 通過分析LAMC2表達(dá)與患者臨床預(yù)后間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LAMC2的表達(dá)可能在部分腫瘤的預(yù)后中起重要作用。并且本研究解析LAMC2的基因改變和LAMC2的表達(dá)量與腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤直接的關(guān)系。

圖6 LAMC2的表達(dá)與不同免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性Fig 6 Correlation between LAMC2 expression and different immune cell infiltration

本研究全面分析了LAMC2在多種腫瘤中的作用，證明了LAMC2是一種重要的致癌基因，可能是有效治療腫瘤的重要靶點(diǎn)。通過研究，希望為LAMC2在人類腫瘤的發(fā)展、治療和預(yù)后中的作用提供新的見解。