GSDMD-N和p-MLKL蛋白在類風濕關節炎滑膜組織中上調

盧 珊，張冰清，葉菜英，朱 蕾*

(1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 藥理學系， 北京 100005；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 普通內科，北京 100730)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周圍關節為主的慢性、系統性和炎癥性自身免疫性疾病。慢性增生性滑膜炎是RA的基本病理改變，是導致關節破壞的重要原因，但目前發生機制尚不十分明確[1]。細胞焦亡(pyroptosis)和程序性壞死(necroptosis)是近年發現的促炎形式的程序性細胞死亡，其觸發時伴有大量細胞內容物的釋放，暴露的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)會激活機體的免疫應答，引起炎性反應[2-3]。這兩種程序性細胞死亡方式被推測是機體防止病原體大量復制并擴散，從而保護機體的有效機制。但越來越多的研究表明，其失調在多種疾病中起重要作用[2-3]。因此，本研究檢測了RA關節滑膜組織中細胞焦亡和程序性壞死相關蛋白的表達水平，并分析其相應的標志性蛋白GSDMD-N和p-MLKL與患者臨床特征及病理滑膜炎之間的相關性，初步探索細胞焦亡和程序性壞死與RA發病的聯系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本的來源：滑膜組織取材2017年12月至2018年12月于北京協和醫院行膝關節置換術的RA患者5例，骨關節炎(osteoarthritis,OA)患者5例。RA患者符合1987年美國風濕病學會(American College of Rheumatology, ACR)修訂的RA分類標準或2010年ACR與歐洲抗風濕病聯盟(European League Against Rheumatism,EULAR)聯合修訂的RA分類標準，并排除其他自身免疫病；OA患者符合2010年ACR膝關節OA分類標準。本研究經中國醫學科學院基礎醫學研究所倫理審查委員會批準(批準號：003-2018)。

1.1.2 臨床資料的收集：記錄患者的性別、年齡、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hsCRP)水平。

1.1.3 試劑：M-PER哺乳動物蛋白質抽提液、蛋白酶及磷酸酶抑制劑Cocktail和電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)底物(Thermo Fisher Scientific公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；兔抗GSDMD單抗和兔抗cleaved-GSDMD單抗(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗caspase-1單抗(Adipogen公司)；兔抗混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)單抗(Invitrogen公司)；兔抗p-MLKL單抗(Abcam公司)；羊抗兔IgG二抗和羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色評估滑膜病理改變：按常規HE染色方法操作，并采用Krenn評分評估病理滑膜炎程度[4]，包括襯里層增生、襯里下層炎性細胞浸潤和基質活化3個亞分，每個亞分根據相應病理改變的輕重程度進行半定量評分(0～3分)，相加為Krenn總分(0～9分)。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達：將滑膜組織樣本按質量體積比1∶7加入預冷的組織蛋白提取液(含1%蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，用勻漿機勻漿15 s，冰上靜置30 min后4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清。同樣條件再次離心取上清。采用BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg，加上樣緩沖液加熱變性，經SDS-PAGE電泳分離后轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，然后用一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST洗膜后室溫孵育相應的二抗1 h，再次用TBST洗膜后進行ECL化學發光并拍照，用ImageJ分析各條帶吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RA組與OA組患者的臨床資料

詳細資料見表1。

表1 RA組與OA組患者臨床資料的比較

2.2 RA和OA患者關節滑膜病理Krenn評分

與OA相比，RA的Krenn總分顯著增加(P<0.05)，其中襯里下層炎性細胞浸潤亞分的增加最為顯著(P<0.01)(圖1)。

2.3 RA和OA關節滑膜組織中細胞焦亡與程序性壞死的比較

與OA滑膜組織相比，RA中pro-caspase-1的表達顯著降低(P<0.01)，caspase-1的表達顯著升高(P<0.05)；GSDMD的表達明顯降低(P<0.05)，而GSDMD-N的表達明顯升高(P<0.05)(圖2)。RA滑膜組織中p-MLKL和MLKL的表達均顯著高于OA關節滑膜(P<0.05)(圖3)。

2.4 細胞焦亡和程序性壞死與臨床指標的相關性

GSDMD-N與ESR呈正相關(r=0.678，P<0.05)，與CRP呈正相關(r=0.725，P<0.05)；p-MLKL與ESR呈正相關(r=0.639，P<0.05)。

A-J.representative HE staining of synovium from OA patients No.1-5 (A-E) and RA patients No.1-5 (F-J)(×100); K.Krenn total score; L.Krenn subscore; *P<0.05，**P<0.01 compared with OA group

*P<0.05，**P<0.01 compared with OA group圖2 RA和OA患者關節滑膜組織中細胞焦亡相關蛋白的檢測Fig 2 Analysis of the related proteins of pyroptosis in synovial tissues from RA and OA patients

*P<0.05 compared with OA group圖3 RA和OA患者關節滑膜組織中程序性壞死相關蛋白的檢測Fig 3 Analysis of the related proteins of necroptosis in synovial tissues from OA and RA patients

2.5 GSDMD-N和p-MLKL與病理滑膜炎的相關性

GSDMD-N與Krenn總分呈正相關(r=0.680，P<0.05)，與襯里下層炎性細胞浸潤亞分呈正相關(r=0.784，P<0.01)；p-MLKL與Krenn總分呈正相關(r=0.664，P<0.05)，與襯里下層炎性細胞浸潤亞分呈正相關(r=0.872，P<0.001)。

3 討論

程序性細胞死亡包括細胞焦亡、程序性壞死、凋亡和自噬等多種細胞死亡方式[2]。其中，細胞焦亡是一種caspase家族依賴性的細胞程序性死亡。在其經典激活途徑中，病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或DAMPs活化炎性小體，使無活性的pro-caspase-1水解為有酶活性的caspase-1，活化的caspase-1將IL-1β和IL-18的前體剪切為成熟體，同時caspase-1切割GSDMD蛋白產生N端產物(GSDMD-N)，后者發生寡聚化并在細胞膜上形成膜孔，使細胞腫脹破裂，釋放細胞內容物和大量促炎因子，引起細胞焦亡[5-6]。關于細胞焦亡的上游通路，即炎性小體的激活可能參與RA的疾病進程已有報道。然而，RA中細胞焦亡的研究相對較少。據報道，與OA患者相比，RA患者外周血CD14+的巨噬細胞中GSDMD-N的表達明顯增加，細胞呈現焦亡樣改變[7]。為了明確RA關節滑膜中是否發生細胞焦亡，比較了RA和OA患者關節滑膜組織中pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD和GSDMD-N的表達水平。結果顯示，與OA相比，RA滑膜組織中pro-caspase-1的表達降低，caspase-1的表達顯著升高；GSDMD的表達降低，而GSDMD-N的表達明顯升高，提示，RA患者關節滑膜中可能發生細胞焦亡。進一步研究發現，細胞焦亡的標志性蛋白GSDMD-N的表達水平與臨床反映RA疾病活動的ESR、CRP以及病理滑膜炎的Krenn總分、襯里下層炎性細胞浸潤亞分呈顯著正相關，提示RA患者關節滑膜的細胞焦亡水平在一定程度上反映了疾病活動度，并可能參與了RA滑膜炎的進程。

程序性壞死是另一種促炎形式的新的細胞程序性死亡方式，死亡細胞形態類似壞死，而其死亡過程受胞內主動機制的調節，由死亡受體介導，以caspase非依賴性方式發生[8-9]。TNF-α、Fas/CD95、LPS、干擾素、病毒DNA以及抗腫瘤藥物等多種刺激可以激活死亡受體誘導程序性細胞壞死[10]，其中 TNF-α誘導的途徑研究最為廣泛。TNF-α與TNFR1結合誘導TNFR1發生構象變化，從而募集包括受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)在內的多種蛋白，形成復合物，并進一步形成由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的壞死小體(necrosome)，MLKL被磷酸化，p-MLKL寡聚化并轉移到質膜形成孔道樣結構，導致膜通透性增加，離子內流，細胞內滲透壓升高，進而發生細胞死亡，細胞內容物釋放，引發免疫和炎性反應[11-12]。文獻報道，膠原誘導性關節炎鼠關節滑膜中p-MLKL的表達水平明顯升高[13]。為進一步明確RA關節滑膜中是否發生程序性壞死，比較了RA和OA患者關節滑膜組織中MLKL和p-MLKL的表達情況。結果顯示，RA關節滑膜中p-MLKL和MLKL的表達水平顯著增高。而且，程序性壞死的標志性蛋白p-MLKL的表達水平與ESR、Krenn總分及襯里下層炎性細胞浸潤亞分呈正相關。提示，RA患者關節滑膜中可能發生程序性壞死，且其可能參與了RA滑膜炎的病理改變。

綜上，RA關節滑膜中細胞焦亡和程序性壞死均明顯增強，且與疾病活動度和滑膜炎性水平呈正相關。提示，細胞焦亡和程序性壞死可能在RA滑膜炎的發病中起重要作用，這為RA的治療提供潛在靶點。相關的體內和體外基礎研究需要進一步開展以深入探討細胞焦亡和程序性壞死在RA發病中的具體機制。