蟲草素抑制哮喘大鼠支氣管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

湯麗萍，閆 瑾，范 芳，王 浩，黃 娜*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 兒科， 陜西 西安 710032； 2.西安醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 陜西 西安 710021)

哮喘(asthma)是最常見的慢性呼吸道疾病，以氣道炎性反應(yīng)、重塑、阻塞和高反應(yīng)性為特征[1]。氣道重塑是哮喘的關(guān)鍵病理特征，與哮喘癥狀的持續(xù)和不良臨床結(jié)局有關(guān)[2]。在氣道重塑過程中，氣道上皮屏障受損、上皮細(xì)胞黏附減少、上皮標(biāo)志物減少以及間質(zhì)標(biāo)志物增多[2]，這些病理改變提示氣道上皮細(xì)胞可能通過上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)參與氣道重塑過程。EMT是上皮損傷后上皮細(xì)胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的高度可塑性過程。TGF-β1的釋放和自分泌、氧化應(yīng)激增強(qiáng)等因素均可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[3]。EMT的發(fā)展通常伴隨著上皮標(biāo)志物(例如E-cadherin)的丟失以及間充質(zhì)標(biāo)志物(例如N-cadherin、α-SMA和vimentin)的表達(dá)[4]。蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種傳統(tǒng)藥用菌。蟲草素(cordycepin，Cor)是從蛹蟲草中分離得到的主要生物活性成分，具有抗缺氧、抗感染、免疫調(diào)節(jié)和抗肝纖維化等多種藥理活性[5]。有研究顯示，蟲草素對慢性哮喘大鼠氣道重塑有明顯的抑制作用[6]。然而，目前還不清楚蟲草素是否通過影響哮喘的EMT過程來改善氣道重塑。為了驗(yàn)證這一推論，本研究使用了一種哮喘大鼠模型和人支氣管上皮細(xì)胞來研究蟲草素在哮喘中的作用以及這一過程中可能涉及的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料:卵白蛋白(ovalbumin，OVA)、蟲草素、0.9%氯化鈉溶液(Sigma Aldrich公司)；Wright-Giemsa、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；E-cadherin一抗、c-Jun一抗、N-cadherin一抗、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMΑ)一抗、vimentin一抗、生物素標(biāo)記的二抗、Alexa Fluor 555偶聯(lián)二抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(Cell Signal Technology公司)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(R&D公司)；聚偏氟乙烯膜(Millipore公司)；Smad3、p-Smad3、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH一抗(Abcam公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz Biotechnology公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(株式會社日本同仁化學(xué)研究所)；Transwell小室(Corning公司)；人支氣管上皮樣細(xì)胞系16HBE(ATCC細(xì)胞庫)。

1.1.2 動物:40只SPF級4～6周齡雄性SD大鼠{空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院[SYXK(陜)2020-004]}，體質(zhì)量為60～80 g。實(shí)驗(yàn)前，大鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下(25 ℃、55%相對濕度、12 h光暗循環(huán)照明)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，不限制食物和水。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理:將大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：對照組、模型組(哮喘模型大鼠，OVA組)、OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組(分別用10和50 mg/kg的蟲草素治療的哮喘大鼠)。分別于第0、7、14天對OVA組、OVA+50 mg/kg Cor組和OVA+200 Cor組大鼠腹腔注射1 mL含有100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行致敏，第21天起用50 μL 1% OVA(溶于0.9%氯化鈉溶液)滴鼻激發(fā)，連續(xù)7 d。另外，在第21天起，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組大鼠在激發(fā)前2 h灌胃10 mg/kg和50 mg/kg的蟲草素(溶于0.9%氯化鈉溶液)。對照組用0.9%氯化鈉溶液致敏、激發(fā)和灌胃，OVA組用0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和計(jì)數(shù)細(xì)胞:最后一次激發(fā)24 h后，處死大鼠，用100 mL PBS沖洗肺，左氣管插管收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，向肺內(nèi)注入3 mL PBS，抽吸3次。將細(xì)胞懸液4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，然后重懸于1 mL 0.9%氯化鈉溶液中。對BALF中的白細(xì)胞進(jìn)行Wright-Giemsa染色并計(jì)數(shù)。

1.2.3 組織學(xué)染色檢測大鼠肺氣道炎性反應(yīng)和氣道重塑:用10%多聚甲醛固定大鼠左肺，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片。HE染色評價(jià)氣道炎性反應(yīng)和氣道重塑程度。Masson三色染色檢測上皮膠原沉積。檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠肺組織E-cadherin和α-SMA的表達(dá)水平:將大鼠肺組織切片烤片、脫蠟和水化后，用3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波爐中進(jìn)行10 min抗原修復(fù)。然后在37 ℃用山羊血清封閉30 min。將切片與E-cadherin和α-SMA一抗在4 ℃過夜孵育(1∶500稀釋)，PBS清洗后，切片與生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min，再與過氧化物酶試劑37 ℃孵育30 min，DAB顯色劑孵育37 ℃孵育5 min。蘇木精復(fù)染核5 min，自來水沖洗反藍(lán)，1%鹽酸乙醇分化5 s。常規(guī)脫水、透明封片后，用ImageJ軟件半定量測定E-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)。

1.2.5 人支氣管上皮樣細(xì)胞系16HBE的培養(yǎng)和處理:將人支氣管上皮樣細(xì)胞16HBE培養(yǎng)在含8%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。TGF-β1用于誘導(dǎo)EMT發(fā)生。用5 ng/mL的TGF-β1和不同濃度的蟲草素(10、20、40、80、160、320 μmol/L)處理16HBE細(xì)胞48 h。此外，將16HBE細(xì)胞分為3組，對照組(未處理的細(xì)胞)、TGF-β1組(5 ng/mL的TGF-β1處理的細(xì)胞)和TGF-β1+Cor組(5 ng/mL的TGF-β1和40 μmol/L蟲草素處理的細(xì)胞)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平:從大鼠肺組織和16HBE細(xì)胞中提取總蛋白并定量，樣品經(jīng)8%、10%或12% SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。在用5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜與E-cadherin(1∶3 000稀釋)、N-cadherin(1∶1 000稀釋)、α-SMA(1∶3 000稀釋)、vimentin(1∶1 000稀釋)、Smad3(1∶2 000稀釋)、p-Smad3(1∶2 000稀釋)、ERK1/2(1∶1 000稀釋)、p-ERK1/2(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶3 000稀釋)的一抗4℃過夜孵育。然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶500稀釋)室溫孵育2 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:將16HBE細(xì)胞按照2 000個(gè)細(xì)胞/孔(100 μL)加入96孔板中，用TGF-β1和蟲草素培養(yǎng)細(xì)胞48 h。然后去除培養(yǎng)基，加入10 μL的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (CCK-8)和100 μL無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵育1～4 h。用BioTek微板分光光度計(jì)檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.8 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移:將Transwell上室中加入2×105個(gè)細(xì)胞和200 μL無血清培養(yǎng)液，下室加入800 μL含10%胎牛血清的完整培養(yǎng)液。37 ℃孵育24 h后，洗滌細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定，下室細(xì)胞用結(jié)晶紫染色。在奧林巴斯熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至下室的細(xì)胞。

1.2.9 免疫熒光染色檢測16HBE細(xì)胞中c-Jun的表達(dá):常規(guī)制作細(xì)胞玻片，用4%多聚甲醛固定20 min，室溫下用0.1% Triton X-100滲透20 min。用牛血清白蛋白清洗和封閉后，將玻片與c-Jun一抗(1∶1 000稀釋)在4 ℃孵育過夜。然后將載玻片與Alexa Fluor 555偶聯(lián)二抗在室溫下孵育2 h。滴加DAPI復(fù)染核5 min，用含熒光猝滅劑的封片液封片，置于顯微鏡下觀察，用ImageJ軟件計(jì)算圖像平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蟲草素對哮喘大鼠炎性反應(yīng)和重塑的影響

與對照組相比，OVA組大鼠BALF的總細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著增加(P<0.05)。與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的上述細(xì)胞計(jì)數(shù)均減少(P<0.05)(表1)。對照組大鼠具有正常的肺組織形態(tài)，OVA組出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，而OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的炎性細(xì)胞浸潤減少(圖1A)。對照組大鼠支氣管周圍無明顯膠原沉積，OVA組可見大面積的支氣管周膠原沉積，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組大鼠膠原沉積較OVA組減少(圖1A)。與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的膠原纖維面積均減少，且呈劑量依賴性方式減少(P<0.05)(圖1B)。

2.2 蟲草素對哮喘大鼠氣道EMT的影響

與對照組相比， OVA組大鼠肺組織中E-cadherin的染色程度降低， 而α-SMA的染色程度增加(P<0.05)；與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的E-cadherin的染色程度升高，而α-SMA的染色程度降低(P<0.05)(圖2)。與對照組相比，OVA組大鼠肺組織中E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與OVA組相比，OVA+10 mg/kg Cor組和OVA+50 mg/kg Cor組的E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平降低，且均呈劑量依賴性方式變化(P<0.05)(圖3)。

表1 大鼠BALF中的細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 1 Count of cells in rat BALF n=3)

A.HE staining and Masson’s trichrome staining image; B.percentage of collagen fiber area in Masson’s trichrome staining; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OVA group; △P<0.05 compared with OVA+10 mg/kg Cor group

2.3 蟲草素對TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮樣細(xì)胞增殖和遷移的影響

與0 μmol/L相比，當(dāng)蟲草素濃度達(dá)到80 μmol/L后，人支氣管上皮樣細(xì)胞16HBE細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)(圖4A)。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將蟲草素濃度設(shè)為40 μmol/L。與對照組相比，TGF-β1組的細(xì)胞活力和遷移細(xì)胞數(shù)均升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的細(xì)胞活力和遷移細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)(圖4B～D)。

A.E-cadherin and α-SMA immunohistochemical staining image; B.average A value of E-cadherin and α-SMA; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OVA group; △P<0.05 compared with OVA+10 mg/kg Cor group

A.Western blot; B.relative protein expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with OVA group; △P<0.05 compared with OVA+10 mg/kg Cor group

A.16HBE cell viability after treatment with different concentrations of cordycepin (CCK-8 method), *P<0.05 compared with 0 μmol/L; B.cell viability of 16HBE treated with 40 μmol/L cordycepin and TGF-β1 (CCK-8 method); C.migrating cells in the Transwell experiment; D.number of migrating cells; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

2.4 蟲草素對TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮樣細(xì)胞EMT的影響

與對照組相比，TGF-β1組16HBE細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，而N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖5)。

2.5 蟲草素對TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮樣細(xì)胞中Smad3、ERK1/2和c-Jun表達(dá)的影響

與對照組相比，TGF-β1組16HBE細(xì)胞中p-Smad3和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的p-Smad3和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。各組的Smad3和ERK1/2蛋白表達(dá)水平均無顯著變化(P>0.05)(圖6)。與對照組相比，TGF-β1組16HBE細(xì)胞中c-Jun的相對熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Cor組的c-Jun的相對熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)(圖7)。

3 討論

據(jù)報(bào)道，蟲草素可降低OVA致敏哮喘小鼠氣道壁厚度、抑制促炎細(xì)胞因子、減少BALF中的嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)[6]。在哮喘小鼠中，蟲草素通過抑制p38-MAPK和NF-κB信號通路來抑制Th2型反應(yīng)，從而發(fā)揮平喘特性[7]。本研究結(jié)果也證實(shí)了蟲草素對哮喘大鼠炎性反應(yīng)和氣道重塑的抑制作用。另外，本研究中，蟲草素以劑量依賴性方式升高哮喘大鼠肺組織中上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平，而降低間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平，這些結(jié)果表明蟲草素抑制了哮喘大鼠EMT過程及氣道重塑。

A.Western blot; B.relative protein expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

A.Western blot; B.relative protein expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

A.immunofluorescence staining image; B.relative fluorescence intensity of c-Jun; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with TGF-β1 group

上皮細(xì)胞是哮喘發(fā)生過程中最具活性的分泌組織細(xì)胞之一，在哮喘氣道重塑過程中，上皮細(xì)胞通過分泌多種生長因子或轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而加速EMT。EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性及細(xì)胞間的黏附作用，并通過細(xì)胞骨架的重組從而獲得遷移能力，進(jìn)一步加速氣道重塑。TGF-β1是細(xì)胞存活和分化的重要調(diào)節(jié)因子，它可以促進(jìn)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞纖維連接蛋白和膠原的產(chǎn)生[8]。目前，越來越多的證據(jù)表明TGF-β1是EMT的誘發(fā)因子[9]。因此，本研究使用TGF-β1培養(yǎng)人支氣管上皮樣細(xì)胞16HBE。結(jié)果顯示，蟲草素抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮樣細(xì)胞的增殖、遷移及EMT，進(jìn)一步證實(shí)了蟲草素在哮喘中對EMT的抑制作用。

Smad蛋白是TGF-β調(diào)控系統(tǒng)的重要胞內(nèi)效應(yīng)器，可介導(dǎo)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β/Smad信號通路是哮喘潛在的治療靶點(diǎn)[10]。抑制氣道上皮細(xì)胞Smad3的產(chǎn)生可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，從而治療哮喘[11]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)1/2信號通路參與調(diào)節(jié)哮喘、慢性氣道炎、氣道高反應(yīng)性等氣道重塑過程[12]。在慢性哮喘大鼠模型中，ERK1/2高度激活[13]。c-Jun參與調(diào)節(jié)哮喘的氣道炎性反應(yīng)和重塑，c-Jun通過與c-fos結(jié)合形成異源二聚體(activator protein 1, AP-1)復(fù)合體調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞下游因子的表達(dá)并加重哮喘[14]。本研究中，蟲草素抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮樣細(xì)胞中Smad3和ERK1/2信號通路的活化及c-Jun的表達(dá)，這可能是蟲草素治療哮喘的機(jī)制。

綜上所述，本研究表明蟲草素抑制哮喘中的EMT，其機(jī)制與對Smad3和ERK1/2信號通路及c-Jun的抑制有關(guān)。因此，蟲草素在治療哮喘方面具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。