氯胺酮減輕大鼠脊髓缺血/再灌注損傷

陳 勇，龐紅利，許遠(yuǎn)征，毛珊珊，洪道先

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科， 河南 開(kāi)封 475001)

脊髓缺血/再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)具有二次損傷的特點(diǎn)，及時(shí)實(shí)施神經(jīng)保護(hù)干預(yù)是改善SCII預(yù)后的關(guān)鍵[1]。氯胺酮(ketamine) 是一種非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，已被證實(shí)可通過(guò)調(diào)控相關(guān)通路、減輕炎性反應(yīng)在小鼠腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[2]，但其對(duì)SCII的作用及其機(jī)制如何目前尚不清楚。胞外調(diào)控蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2信號(hào)通路已被證實(shí)參與包括SCII在內(nèi)的多種器官的缺血/再灌注損傷過(guò)程[3-4]，因此，本研究擬探討不同劑量氯胺酮對(duì)SCII的作用及ERK1/2信號(hào)通路的影響，為SCII的預(yù)后改善措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(300±15)g[河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物檢疫許可證號(hào)：SYXK(豫)2017-0001]。鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司)；兔抗ERK1/2單克隆抗體、兔抗大鼠p-ERK1/2單克隆抗體和山羊抗兔IgG(Invitrogen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物的分組處理：大鼠分為假手術(shù)組(S組)、SCII組、ketamine-L和ketamine-H組，每組8只。采用Zivin法[5]建立大鼠SCII模型：禁食不禁水8 h，腹腔注射1%戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，取仰臥位固定，沿腹正中偏左向下切開(kāi)3 cm，暴露并分離腹主動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉45 min后松開(kāi)。待檢查無(wú)出血，縫合傷口并涂抹紅霉素軟膏，并連續(xù)3 d腹腔注射硫酸慶大霉素液0.1 mg。S組大鼠行相同手術(shù)但不做夾閉處理。再灌注術(shù)后1 d，ketamine-L和ketamine-H組分別腹腔注射50和100 mg/(kg·d)氯胺酮，連續(xù)14 d；S和SCII組注射等體積0.9% NaCl溶液。本研究已經(jīng)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào)：2020-0603)。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：采用改良Tarlov評(píng)分[6]評(píng)定大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能(表1)，術(shù)后6 h評(píng)分0～4分為造模成功。記錄各組大鼠再灌注后1、3、7和14 d的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果。

1.2.3 Nissl染色觀察脊髓組織：14 d后斷頭處死

表1 改良Tarlov評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Modified Tarlov criteria

大鼠，分離腰椎L3～L5節(jié)段脊髓，其中L4～L5節(jié)段置于-80 ℃冰箱中保存，L3～L4節(jié)石蠟包埋后切片。取組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，用甲基紫染色液于56 ℃染色1 h，沖洗后用Nissl Differentiation(尼氏分化液)分化1～3 min，無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察神經(jīng)元并計(jì)數(shù)。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)脊髓神經(jīng)元凋亡率：取組織石蠟切片脫蠟復(fù)水，漂洗后滴加蛋白酶K修復(fù)液，37 ℃孵育30 min，3% H2O2去內(nèi)源性雜質(zhì)，清洗后滴加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育2 h，滴加3% BSA室溫下封閉30 min；滴加DAB顯色，DAPI復(fù)染，封片后熒光鏡下觀察并采集圖像。計(jì)算脊髓前角細(xì)胞凋亡率：凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)脊髓組織炎性因子：取大鼠脊髓組織，勻漿，3 000 r/min離心15 min后取上清，按照ELISA試劑盒檢測(cè)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-1，IL-6)及血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)水平。

1.2.6 脊髓組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)：取上述脊髓組織上清液檢測(cè)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)活性及髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Erk1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)：取凍存脊髓組織加入200 μL RIPA緩沖液磨成勻漿，室溫孵育2 min，4 ℃ 14 000～16 000×g離心2 min，收集上清，提取脊髓組織總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。隨后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后滴加一抗ERK1/2、p-ERK1/2，4 ℃孵育過(guò)夜后加二抗孵育1.5 h。ECL曝光成像，Image J定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)量：目的條帶與內(nèi)參β-actin的吸光度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)學(xué)評(píng)分比較

與S組相比，再灌注1 d后SCII組大鼠后肢評(píng)分均顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與SCII組相比，再灌注3 d后ketamine-L和ketamine-H組評(píng)分均顯著升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group圖1 各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能改良Tarlov評(píng)分分析Fig 1 Modified Tarlov score analysis of hind limb motor function of rats in each group

2.2 Nissl染色分析

與S組相比，SCII組陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均明顯增加(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group圖2 各組脊髓組織Nissl染色分析Fig 2 Nissl staining analysis of spinal cord tissue in each

2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

與S組相比，SCII組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組細(xì)胞凋亡率均顯著下降(P<0.05)(圖3，表2)。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較分析

2.4 脊髓組織炎性因子水平變化

與S組相比，SCII組IL-1β、TNF-α、IL-6及VCAM-1水平均顯著升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組各因子水平均顯著下降(P<0.05)(表3)。

2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化

與S組相比，SCII組SOD和GPX水平明顯降低，MDA、MPO水平顯著升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-L和ketamine-H組SOD和GPX水平明顯升高，MDA、MPO水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

2.6 Erk1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與S組相比，SCII組p-ERK1/2及p-ERK1/2/ERK1/2值均明顯升高(P<0.05)；與SCII組相比，ketamine-H和ketamine-L組回降(P<0.05)(圖4)。

圖3 TUNEL法檢測(cè)各組大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況Fig 3 Apoptosis of spinal cord tissue cells in each group was detected by TUNEL method (×200)

表3 各組脊髓組織炎性因子水平變化Table 3 Changes of inflammatory cytokines in spinal cord tissue in each

表4 各組脊髓組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化Table 4 Changes of indexes related to oxidative stress in spinal cord tissue in each

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group圖4 ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 4 Expression of ERK1/2 signaling pathway related proteins

3 討論

研究表明SCII的發(fā)生涉及多種機(jī)制，病理過(guò)程可能與神經(jīng)元變性、細(xì)胞凋亡和ERK1/2等信號(hào)通路的激活密切有關(guān)，且常伴有細(xì)胞內(nèi)外離子紊亂、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及氧自由基增多等[7]。本研究中SCII大鼠Tarlov評(píng)分、陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目及SOD和GPX水平顯著降低，凋亡率、炎性因子及MDA、MPO水平顯著升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了現(xiàn)有研究結(jié)果。因此推測(cè)，抑制炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、阻止神經(jīng)細(xì)胞損害和凋亡，是改善SCII病情的關(guān)鍵。

氯胺酮是一種臨床廣泛應(yīng)用的苯環(huán)已哌啶類靜脈麻醉劑。近年來(lái)，有研究表明[8]氯胺酮除麻醉作用外，還具有一定的抗感染和神經(jīng)保護(hù)作用，可減輕多種器官的缺血再灌注損傷程度。如抑制心肌缺血再灌注細(xì)胞中Toll樣受體4(TLR4)和NF-κB的表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]；抑制NF-κB并激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路，降低肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率、炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平及MDA含量和MPO活性，提高SOD活性[10]；提高腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低細(xì)胞凋亡率和炎性反應(yīng)，影響NF-κB信號(hào)通路減輕損傷程度[11]。但目前關(guān)于氯胺酮與SCII作用關(guān)系的研究報(bào)道極少。為明確二者的作用關(guān)系，本研究檢測(cè)不同劑量氯胺酮處理的SCII大鼠的脊髓細(xì)胞凋亡、炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，評(píng)估Tarlov，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯胺酮處理的SCII大鼠Tarlov評(píng)分均顯著升高，神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及SOD和GPX活性增高，細(xì)胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、VCAM-1水平及MDA含量、MPO活性顯著降低，提示氯胺酮可減輕SCII程度，且低劑量效果更優(yōu)。此外，氯胺酮可通過(guò)抑制ERK1/2信號(hào)通路減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)，改善抑郁大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)[12]。但氯胺酮在SCII中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用是否與ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)目前尚無(wú)明確報(bào)道，而本研究中發(fā)現(xiàn)SCII大鼠p-ERK1/2、p-ERK1/p-ERK2和ERK1/ERK2明顯升高，氯胺酮處理后ERK1/2磷酸化水平回降，且低劑量回降幅度大于高劑量。

綜上所述，低劑量氯胺酮可減輕SCII程度，且ERK1/2信號(hào)通路可能參與該過(guò)程，但尚需后續(xù)更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。