膿毒癥早期BMP-2和BMP-4的變化

溫 燕，林金燦，黃穎泓，肖文彪，張民偉，林建東*

(1.福建醫科大學附屬第一醫院 重癥醫學科， 福建 福州 350005； 2.廈門大學附屬第一醫院 重癥醫學科，福建 廈門 361003)

膿毒癥(sepsis)定義為，由感染引起的機體反應失調所致的危及生命的器官功能障礙[1]。在膿毒癥的病理過程中，血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)是病原體及其毒素的主要靶點。已證實內皮功能障礙早期參與了膿毒癥的發生發展[2]。因此，早期評估膿毒癥內皮細胞損傷，可為膿毒癥診斷和治療提供有價值的信息。

研究表明，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族的不同亞型與血管生物學有關。BMP信號主要由BMP-2/4/6/9/10觸發，其中BMP-2和BMP-4存在于人微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MECs)中，調節EC的遷移和毛細血管的形成[3-4]，BMP-2和BMP-4表達上調可誘導內皮促炎表型，增強白細胞與內皮的間黏附[5-7]。這表明，BMP-2/4信號級聯反應可影響內皮細胞生物學行為，BMP-2/4信號通路可能成為內皮細胞損傷修復的潛在靶點。

然而，目前關于BMP-2/4信號通路的研究多集中于大血管內皮細胞，BMP-2/4在膿毒癥微血管內皮功能障礙中的作用尚未明確。因此，本研究旨在探討BMP-2和BMP-4在膿毒癥早期的變化及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試者：根據2016年膿毒癥國際指南診斷膿毒癥[1]。入選自2017年5月1日至2020年5月1日入住廈門大學附屬第一醫院重癥監護病房(intensive care unit，ICU)和福建醫科大學附屬第一醫院 ICU 的膿毒癥患者(膿毒癥組)和非膿毒癥患者(非膿毒癥組)。招募18歲以上的健康志愿者作為對照組。膿毒癥組的入選標準：1)年齡>18周歲；2)確診膿毒癥；3)膿毒癥的上游疾病為細菌性肺部感染或腹腔感染。非膿毒癥組的入選標準：1)年齡>18周歲；2)輕型肺部細菌感染患者或因腹部器官非感染性疾病入住ICU的患者；3)ICU住院期間無新發感染。膿毒癥組和非膿毒癥組的排除標準為：1)自身免疫性疾病；2)腫瘤活動期；3)骨修復期；4)肺血管疾病如肺動脈高壓、肺栓塞等。健康對照組的排除標準為:1)入組前1個月內患有細菌或病毒感染；2)入組前1個月內接受過抗生素治療。該研究經福建醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準[閩醫大附一倫理醫研(2021204)]。所有受試者或其法定監護人需簽署知情同意書。該研究符合1975年赫爾辛基宣言的倫理準則。

收集所有受試者的一般信息，及膿毒癥組和非膿毒癥組的感染性指標。

1.1.2 試劑及試劑盒：BMP-2、BMP-4和內皮素-1(endothelin-1，ET-1)酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(博士德生物技術有限公司)，總 RNA 純化試劑盒、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)結合的山羊抗兔 IgG 抗體和 DAB 顯色液(上海生工生物技術有限公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒和TaqMan探針(TaKaRa公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma-Aldrich公司)；抗BMP-2抗體、抗磷酸化 Smad1/5(phosphorylated Smad1/5，pSmad1/5)抗體和抗BMP受體Ⅱ(BMP receptor Ⅱ，BMPRⅡ)抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.3 細胞：原代大鼠肺微血管內皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMECs)(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 采集血樣：收集膿毒癥組(24例)和非膿毒癥組(25例)患者入住 ICU 24 h 內及健康志愿者(對照組，24例)的空腹外周靜脈血標本，離心獲得血清，將血清樣品等分后，-20 ℃ 保存。

1.2.2 ELISA定量檢測BMP2、BMP-4和 ET-1：按照試劑盒說明書，測定血清 BMP-2、BMP-4和 ET-1濃度。用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度(A)值。

1.2.3 RPMECs 的培養和處理:于37 ℃含5% CO2的培養箱培養原代 RPMECs。第2～3代的 RPMECs 用于實驗。用梯度濃度的 LPS(0、10、100和1 000 ng/mL)孵育 RPMECs[8]，3 h 后收集 RPMECs，提取總蛋白和總 RNA。

1.2.4 免疫印跡法檢測BMP-2、pSmad1/5和 BMPRⅡ：用1.2.3中的 RPMECs 總蛋白，按文獻報道[8]的方法進行免疫印跡分析；用Image J軟件分析蛋白質的相對表達量。

1.2.5 RT-qPCR檢測 BMP-2 mRNA和 BMPRⅡ mRNA：用1.2.3中的 RPMECs總 RNA，按PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒說明進行反轉錄。用 LightCycler480系統和 Taqman 探針進行 qPCR。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 受試者一般特征

最終入選24例膿毒癥患者(膿毒癥組，n=24)、25例非膿毒癥患者(非膿毒癥組，n=25)及24例健康志愿者(對照組，n=24)。與非膿毒癥組相比，膿毒癥組患者入ICU后24 h 內的感染性標志物水平顯著較高，包括血小板(platelet，PLT)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和白介素(interleukin，IL)-6(P<0.05)；膿毒癥組死亡率顯著較高，有更多的患者合并有多器官功能衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、需要機械通氣，且機械通氣時間顯著較長(P<0.05)。

2.2 膿毒癥患者中血 BMP-2和 BMP-4的濃度顯著升高

膿毒癥組早期血清 BMP-2 和 BMP-4 水平顯著較高于對照組(P<0.05)，且膿毒癥組 BMP-2水平顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)(圖1)。

There were significant differences on BMP-4(F=3.79，P=0.03) and BMP-2(F=6.36，P=0.003) between the three groups; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with non-sepsis圖1 膿毒癥組、非膿毒癥組和對照組間BMP-2、BMP-4和ET-1的比較Fig 1 Comparisons of BMP-2, BMP-4 and ET-1 between sepsis group, non-sepsis group and control group

2.3 BMP與膿毒癥相關的生物標志物之間的相關性

Pearson相關性分析顯示，膿毒癥組患者入住 ICU 24 h 內的 BMP-2 水平與 PCT(r=0.45，P<0.01)、乳酸(r=0.66，P<0.01)、以及 IL-6(r=0.59，P<0.01)呈顯著正相關，且其BMP-4 與 ET-1(r=0.57，P<0.01)和 CRP(r=0.54，P<0.05)間亦呈顯著正相關；而非膿毒癥組僅 BMP-4 與 CRP(r=0.66，P<0.01)呈顯著正相關。

2.4 BMP-2具有良好的膿毒癥診斷性能

ROC 曲線分析 BMP-2 對膿毒癥與健康志愿者診斷價值，結果顯示出良好診斷性能(AUC=0.94，cutoff 值：50.40 pg/mL，靈敏度：87.50%，特異性：95.83%)；且BMP-2在區分膿毒癥患者與ICU非膿毒癥患者時(AUC=0.85，cutoff 值: 54.66 pg/mL，靈敏度:87.50%，特異性: 76.00%)也顯示出良好診斷性能。本研究中所有ROC 曲線分析均未顯示BMP-4對膿毒癥的良好診斷性能。

2.5 LPS 對RPMECs的SMAD信號通路蛋白表達的影響

2.5.1 LPS處理的RPMECs的BMP-2表達的變化：LPS可誘導 RPMECs的BMP-2表達增加，且該效應具有LPS濃度依賴性(圖2A,B)。當 LPS 濃度≥100 ng/mL 時，經 LPS 處理的 RPMECs 的 BMP-2 表達顯著高于對照組(P<0.05，圖2A,B)。

2.5.2 LPS對RPMECs 的 BMP/Smad1/5/8信號通路的影響：LPS 可顯著降低 RPMECs 的pSmad1/5和 BMPRⅡ 表達，且降低程度均與LPS濃度呈劑量依賴關系(P<0.05)(圖3A～C)，另外BMPRⅡ mRNA的表達顯著降低(P<0.05)(圖3D)。

A.expression of BMP-2 detected by Western blot; B.relative expressions of BMP-2 of RPMECs grouped by concentrations of LPS; *P<0.05 compared with control group

A-C.expressions of pSmad1/5 and BMPRⅡ in LPS-treated PMECs were lower than them in untreated PMECs; D.RT-qPCR showed mRNA expressions of BMPRⅡ in LPS-treated PMECs lower than them in untreated PMECs; *P<0.05 compared with group control; #P<0.05 compared with non-sepsis group

3 討論

非感染性炎性研究表明，BMP-2/4在血管炎性反應中表達顯著上調，是血管壁中的促炎和促動脈粥樣硬化因子[5-6,9-10]。這提示BMP可參與人體炎性反應。盡管研究表明，經LPS處理的小鼠肺部BMP-2表達顯著升高[7]，但極少有研究報道BMP在臨床感染性疾病中變化。本研究經臨床觀察首次證實膿毒癥早期BMP-2/4水平顯著升高，且BMP-2對感染性炎性反應更加敏感，并對膿毒癥有良好的診斷功能，可能在早期膿毒癥的診斷中起重要作用。

內皮細胞炎性是膿毒癥的關鍵病理生理特征，主要表現為肺微血管完整性受損和內皮功能障礙[1,2]。通過細胞模型，本研究發現經LPS處理的RPMECs的BMP-2的表達明顯更高，這進一步證實了上述臨床發現。既往研究表明，BMP-2可促進白細胞黏附內皮細胞，這將誘導細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和核因子-κB的表達升高，從而引起內皮細胞炎性反應[7]。由BMP-2誘導產生的炎性因子又可下調BMP受體表達，進而經Smad1/5/8通路抑制BMP信號傳導，從而增加內皮細胞中的ICAM表達和白細胞黏附[11-13]。本研究顯示經LPS處理的肺微血管內皮細胞的磷酸化Smad1/5和BMPRⅡ表達顯著受抑制。這表明在膿毒癥早期，BMP-2在發揮促炎作用的同時，伴有Smad1/5/8信號通路抑制，這進一步加劇了促炎反應過程。

綜上所述，本研究證實膿毒癥早期BMP-2表達顯著升高，LPS可抑制Smad1/5/8信號通路，兩者共同驅動內皮細胞炎性反應。這表明BMP-2可能是潛在的膿毒癥早期診斷標志物且在膿毒癥早期起促炎作用。