槐花顆粒抗氧化成分提取液體外抗氧化活性及抑菌作用研究*

辛曉芳，劉特津，潘童心

（1. 廣州中醫藥大學附屬中山中醫院，廣東 中山 528401； 2. 廣東藥科大學，廣東 中山 528458）

槐花顆粒由槐花、野菊花等經現代制藥工藝提取、濃縮、干燥制粒而成，具有涼血止血、清熱解毒、瀉火平肝功效，用于治療便血、痔血、肝熱目赤、頭痛眩暈，同時還可治療血痢、崩漏、吐血、衄血。方中，槐花為君藥，野菊花為臣藥。槐花主要含蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物，對超氧陰離子和1，1 - 二苯基 - 2 - 3 硝基苯肼（DPPH）自由基具有較強的清除能力［1］，槐花多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌作用良好［2］。野菊花具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等活性，還原能力較強，且對超氧陰離子有較強的清除能力［3］。菊花對金黃色葡萄球菌的抑菌作用良好［4］。本研究中探討了槐花顆粒的體外抗氧化活性和抑菌作用及作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌種

儀器：UV-2550型紫外分光光度計（Shimadzu Corporation）；Multiskan FC 型酶標儀（賽默飛世爾<上海>儀器有限公司）；BH - DHS - 35 型隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，精度為萬分之一）；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；DDB - 303A 型便攜式電導率儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；HN192007 - 20 - 004 型醫用離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；3870J 型立式滅菌器（精銳科學儀器有限公司）；BSC - 1100ⅡB2 型生物安全柜（蘇州諾達凈化科技有限公司）。

試藥：槐花顆粒（院內制劑，批號為20001）；DPPH（梯希愛<上海>化成工業發展有限公司，批號為BFQNI-SL）；維生素C 片（佛山手心制藥有限公司，批號為2011109）；雙氧水（H2O2，貝斯特集團有限公司，批號為B00060001）；Tris - HCl 緩沖液（杭州聯科生物技術有限公司，批號為71712251）；濃鹽酸（西隴化工股份有限公司，批號為201912051）；Mueller - Hinton（MH）瓊脂培養基（杭州威晟生物科技有限公司，批號為1086721）；營養肉湯培養基（江門市凱林貿易有限公司，批號為1083215）；空白藥敏紙片（比克曼生物有限公司，直徑為6 mm）。

菌種：金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus（廣東省中山市中醫院標準金黃色葡萄球菌菌株，編號為ATCC29213）。

1.2 體外抗氧化活性試驗

1.2.1 溶液制備

取樣品適量，120 ℃干燥至恒重，取10 g，精密稱定，加入無水乙醇50 mL，于70 ℃水浴加熱3 h［5］，趁熱濾過，置50 mL容量瓶中，用少量無水乙醇洗滌容器，收集洗液，放冷，用乙醇定容至50 mL容量瓶中［6］。按生藥量換算，即得質量濃度為320 mg/mL 的提取液，吸取5 mL，定容至100 mL容量瓶中，即得質量濃度為16 mg/mL的抗氧化成分提取液A液，稀釋得質量濃度為8，4，2 mg/mL的抗氧化成分提取液。取樣品9.375 g，重復上述步驟，用無水乙醇提取，定容至50 mL容量瓶中，取2 mL，定容至100 mL容量瓶中，即得抗氧化成分質量濃度為6 mg/mL的提取液［6］。

1.2.2 抗氧化能力測定

對DPPH 自由基的清除能力：分別取0.5 mL 不同質量濃度（2，4，6，8 mg/ mL）的提取液和陽性對照溶液，置具塞試管中，加入2.0 mL DPPH 溶液［7］、1.5 mL純化水，充分混勻，快速振蕩，室溫下避光放置30 min。采用紫外分光光度計分別于517 nm 波長處測定吸光度，從相同體積純化水作空白對照。按公式［8］計算對DPPH自由基的清除率，清除率越高，抗氧化能力越強。

清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

式中，A0為純化水的吸光度，A1為提取液+陽性對照溶液的吸光度，A2為提取液的吸光度。

對超氧陰離子自由基的清除能力：分別取1 mL 不同質量濃度的提取液（2，4，6，8 mg/mL）和陽性對照溶液，置試管中，分別加入4 mL 50 mmol/ L Tris - HCl（pH 8.2）緩沖液、0.5 mL 25 mmo/L 鄰苯三酚溶液，靜置10 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應，于299 nm波長處測定吸光度（Ax）。用相同體積蒸餾水代替提取液，作空白對照，測得A0。按公式［9］計算清除率。

金門巖體位于英德弧形構造前弧東翼內側，NE向雪山嶂—浪傘頂背斜東翼，NE向構造與EW向構造交匯區，呈橢圓狀到不規則狀侵入金門背斜(雪山嶂背斜)軸部泥盆系東崗嶺組(D2d)中，向南東深部側伏，地表出露面積約為1.5km2(圖2)。該巖體與其侵入的泥盆系發生強烈的接觸變質作用，形成大量的矽卡巖(圖3)，外接觸帶即為磁鐵礦化矽卡巖(圖4)。據重磁推斷，區內存在規模巨大的隱伏巖體，北部與大東山-貴東巖體相連，南部與佛岡巖體相接[5]。

清除率（%）=［A0-Ax］/A0×100%

對Fe3+的還原能力：分別取2.5 mL 不同質量濃度的提取液（2，4，6，8 mg/ mL）和陽性對照溶液，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.6）和10 g/L鐵氰化鉀溶液50 ℃恒溫水浴20 min，加2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心（轉速為3 000 r/min）10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，于700 nm 波長處測定吸光度，并繪制質量濃度-吸光度曲線。

對過氧化氫的清除能力：分別取2.4 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4）、0.6 mL 40 mmol/L 過氧化氫溶液，置具塞試管中，分別加入1 mL不同質量濃度的提取液（2，4，6，8 mg/mL）和陽性對照溶液，混勻，劇烈振蕩，室溫下放置10 min，于230 nm 波長處測定吸光度（A樣）。用相同體積水代替樣品測得A損傷，用相同體積水代替過氧化氫測得A未損傷，按公式計算清除率。

清除率（%）=（A樣-A損傷）/（A未損傷-A損傷）× 100%

1.3 體外抑菌效果研究

1.3.1 培養基制備

取牛肉膏3 g，精密稱定，取蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加入蒸餾水1 000 mL，調pH 至7.4，高壓滅菌，即得液體培養基。取牛肉膏3 g，精密稱定，取10 g 蛋白胨、18 g瓊脂、5 g 氯化鈉，溶于 1 000 mL 蒸餾水，調 pH 至 7.4，高壓滅菌，倒入培養皿，即得固體培養基。

1.3.2 提取液、菌懸液制備

提取液：取樣品25 g，精密稱定，加入50 mL 蒸餾水，加熱回流20 min，濾液用水補足至50 mL，即得質量濃度為0.8 g / mL 的提取液（低劑量組），同法制備3.1 g/mL 和1.6 g/mL 的提取液（高、中劑量組）。將提取液置滅菌器中滅菌（121 ℃，15 min），備用。

菌懸液：在生物安全柜中進行無菌操作，先將裝有5 mL 無菌生理鹽水的試管置比濁儀中進行比濁度調零，用接種環挑取金色葡萄球菌標準菌株置已調零的試管中，置漩渦混勻器，混勻，置比濁儀中進行測量，至0.5麥氏比濁度，即得菌懸液。

1.3.3 瓊脂擴散法測定抑菌環直徑

將藥敏紙分別浸泡于高、中、低劑量組的已滅菌平皿中12 h，傾出剩余藥液，將平皿置37 ℃恒溫箱中密閉熱干。將濃度為108cfu/ mL 的菌液用無菌棉簽均勻涂布于MH 瓊脂培養基，用無菌鑷子［10-11］將浸泡好的藥敏紙粘貼在平板上，分別為高、中、低劑量組（3.1，1.6，0.8 g/mL），培養24 h，測定抑菌環直徑，并確定提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.3.4 最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）測定

MIC：采用二倍稀釋法［12］進行稀釋，得到質量濃度分別為 780.0，390.0，195.0，97.5，48.8，24.4，12.2，6.1，3.1，1.6 mg/ mL 的提取液，與培養基制成具有濃度梯度的含藥培養基。在超凈工作臺內，取無菌96 孔板，第2 孔至第12 孔均加入低劑量組提取液100 μL 肉湯培養基，分別吸取低劑量組提取液100 μL，注入第1孔和第2 孔，反復吹打，充分混勻；于第2 孔中吸取100 μL注入第3 孔，等倍稀釋，直至第10 孔，吹打，混勻，棄去100 μL。第11孔為不加提取液的受試菌對照管，即為陰性對照組；第12孔為加入60%乙醇的受試菌對照管，即為陽性對照組。第1 孔至第12 孔中加入調整好的菌液10 μL，且每孔最終含菌濃度為 5 × 105cfu/ mL。以第 1列為空白孔進行調零，于600 nm 波長處測定各孔A0［13］，重復 3 次，取平均值作為本底。于 37 ℃培養箱中培養24 h，測定A1，重復3次，求平均值。同時，以A1與A0的差值（試驗微孔的A凈值）判斷MIC。根據公式計算，A凈值> 0.02 視為有菌生長，以完全無菌生長的最低濃度為MIC。

MBC：取上述測定MIC的96 孔板，分別從無菌生長的試驗孔中吸取培養基100 μL，注入MH瓊脂培養基表面，涂布均勻，置37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，取出，采用活菌計數法計數菌落，將培養基中平均菌落數少于5的最小生藥濃度記作MBC［14］。重復3次，取平均值。

1.4 體外抑菌作用機制研究

細菌細胞膜電導率測定：將細菌培養至對數生長期，接種至營養肉湯液體培養基中，分別加入稀釋后的提取液。搖床培養，分別于0，2，4，6，8 h 時取菌液4 mL，離心（轉速為5 000 r/min）10 min，取上清液，測定電導率。重復3次，取平均值。

細菌培養液中DNA 及RNA 等大分子含量測定：取不同質量濃度槐花顆粒提取液（0.8，1.6，3.1 g/mL），加入菌懸液，搖勻，使藥物終濃度分別為MIC的0，2，4，8 倍，含菌濃度為106cfu/mL，取上述培養基置37 ℃培養1 h，取樣，離心（轉速為4 500 r/min）10 min，取上清液，稀釋20倍，于260 nm波長處測定吸光度［15］。

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化活性試驗

對DPPH 自由基的清除能力：由圖1 可知，不同質量濃度（2～8 mg/mL）抗氧化成分提取液對DPPH 自由基均有較強的清除能力，且與質量濃度存在量效關系，清除能力隨著質量濃度的增加而增強；質量濃度為8 mg/mL時，與陽性對照溶液的清除能力相近。

圖1 槐花顆粒抗氧化成分提取液對DPPH的清除能力Fig.1 Scavenging ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to DPPH

對超氧陰離子自由基的清除能力：由圖2 可知，不同質量濃度（2～8 mg/ mL）抗氧化成分提取液對超氧陰離子均有較強的清除能力，但弱于陽性對照溶液；清除能力隨著質量濃度的增加而增強，表現出較好的清除能力。

圖2 槐花顆粒抗氧化成分提取液對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to superoxide anion radical

對Fe3+的還原能力：由圖3 可知，不同質量濃度（2～8 mg/mL）抗氧化成分提取液對Fe3+均有較強的還原能力，比陽性對照溶液的還原能力強，且還原能力隨著質量濃度的增加而增強。

圖3 槐花顆粒抗氧化成分提取液對Fe3+的還原能力Fig.3 Reduction ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to Fe3 +

對過氧化氫的清除能力：由圖4 可知，不同質量濃度（2～8 mg/ mL）提取液對過氧化氫均有良好的清除能力，清除能力隨著質量濃度的增加而增強，質量濃度為8 mg/mL時比陽性對照溶液清除能力強。

圖4 槐花顆粒抗氧化成分提取液對過氧化氫的清除能力Fig.4 Scavenging ability of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules to hydrogen peroxide

2.2 體外抑菌試驗

對金黃色葡萄球菌的抑菌效果：不同槐花顆粒抗氧化成分提取液（質量濃度為0.8，1.6，3.1 g/mL）的抑菌環直徑分別為5.0，7.0，10.0 mm，對金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果，且抑菌效果隨著質量濃度的升高而增強。結果見圖5。

圖5 槐花顆粒抗氧化成分提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑Fig.5 Antibacterial circle diameters of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules against Staphylococcus aureus

MIC：槐花顆粒抗氧化成分提取液對金黃色葡萄球菌的抑制作用見表1。可見，MIC為48.8 mg/mL。

表1 槐花顆粒抗氧化成分提取液對金黃色葡萄球菌的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules on Staphylococcus aureus

MBC：質量濃度為 390.0 mg/ mL 時，MH 培養基中菌落數為1，滿足平均菌落數少于5的要求，故槐花顆粒抗氧化成分提取液的MBC為390.0 mg/mL。

2.3 槐花顆粒抑菌機制研究

對細菌細胞膜電導率的影響：細胞膜為細胞正常生命活動提供了相對穩定的內環境，參與了細胞與周圍環境中的物質交換過程，保持了細胞內外滲透壓的平衡。在槐花顆粒抗氧化成分提取液的作用下，細菌的細胞膜遭到破壞，表現為培養基電導率的改變。由圖6可知，電導率隨著槐花顆粒抗氧化成分提取液對金黃色葡萄球菌作用時間的延長而增加，細菌體內有電解質滲出，表明槐花顆粒抗氧化成分提取液可能通過破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜和細胞壁而抑制其生長。

圖6 槐花顆粒抗氧化成分提取液對電導率的影響Fig.6 Effect of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules on electrical conductivity

對細菌培養液中DNA 及RNA 等大分子含量的影響：在槐花顆粒抗氧化成分提取液的作用下，細菌的細胞膜遭到破壞，細胞內DNA 及RNA 等大分子物質的外漏，于260 nm 波長處菌體培養液的吸光度升高。由圖7可知，吸光度隨著槐花顆粒抗氧化成分提取液質量濃度的增加而升高，表明槐花顆粒抗氧化成分提取液通過破壞細菌細胞膜抑制金黃色葡萄球菌。

圖7 槐花顆粒抗氧化成分提取液對大分子含量的影響Fig.7 Effect of antioxidant ingredients exact of Huaihua Granules on macromolecular contents

3 討論

由本研究結果可知，槐花顆粒具有良好的抗氧化活性，對DPPH 自由基、超氧陰離子、過氧化氫均有良好的清除能力，對Fe3+有良好的還原能力，且隨著抗氧化成分質量濃度的增加而升高。若人體內缺少抗氧化物，會造成體內自由基過多，易致人體健康受損，甚至誘發痔血、便血。槐花顆粒具有涼血止血、清肝瀉火功效，可能與槐花顆粒的抗氧化活性有一定關系。此外，槐花顆粒抗氧化成分提取液對金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果。由MIC和MBC試驗結果可知，較低濃度即有抑菌效果，且MBC在治療劑量內。通過破壞金黃色葡萄球菌的細胞壁和細胞膜，可抑制其生長。痔血易導致肛門感染，細菌、毒素、膿栓易侵入血液引發敗血癥、毒血癥，槐花顆粒抗氧化成分提取液抑菌效果良好，可降低肛門感染細菌的風險。后續將進一步研究其體外抗氧化活性及其抑菌機制和藥理作用。