高效液相色譜法測定杞菊地黃制劑中毛蕊花糖苷含量

南榮華 ，吳 芳 ，康小風 ，黃 艷 ，李 翠 ，2，戴 涌 ，2△

（1. 陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065； 2. 國家藥品監督管理局藥品微生物檢驗技術重點實驗室，陜西 西安 710065）

杞菊地黃制劑主要由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等中藥材經提取加工制成，用于治療肝腎陰虧、頭暈耳鳴、明畏光、迎風流淚、視物昏花［1］。熟地黃采取酒燉蒸煮的炮制方法，藥性微溫，味道甘甜，有益精填髓、補血滋陰功效。熟地黃富含氨基酸、地黃素、糖類、梓醇等多種微量元素［2］，具有抗衰老、抗氧化、促進造血、增強免疫力的藥理學作用［3-5］。毛蕊花糖苷為常用于熟地黃質量評價的指標性成分，但2020 年版《中國藥典（一部）》僅對杞菊地黃制劑中芍藥苷、馬錢苷進行含量測定［6-7］。本研究中建立了測定杞菊地黃制劑（片劑和口服液）中毛蕊花糖苷含量的高效液相色譜法，為系統評價其質量提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有G7115A型紫外檢測器、Waters Empower工作站；P211D 型分析天平（精度為0.01/ 0.1 mg），BS224S 型分析天平（精度為0.000 1 mg），均購自德國賽多利斯公司；HH - S8A 型恒溫水浴鍋（北京科偉公司）；UPH - 11 - 10T 型超純水機（優普科技股份有限公司）。

1.2 試藥

毛蕊花糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111530 - 201411，含量為94.4%）；杞菊地黃制劑（2018 年國家評價性抽驗樣品）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Spolar C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 - 0.1%甲酸溶液（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；進樣量：10 μL。理論板數以毛蕊花糖苷峰計應不低于4 000。

2.2 溶液制備

取毛蕊花糖苷對照品7.18 mg，精密稱定，加甲醇定容至100 mL 容量瓶中，搖勻，精密量取2 mL，定容至10 mL 容量瓶中，即得每1 mL 含毛蕊花糖苷14.36 μg的對照品溶液。精密量取杞菊地黃口服液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得口服液供試品溶液。取杞菊地黃片，除去包衣，研磨均勻，取3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定質量，于80 ℃水浴加熱30 min［6］，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液50 mL，蒸干，用甲醇轉移至10 mL容量瓶中并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得片劑供試品溶液。按處方工藝制備不含熟地黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：吸取 2.2 項下 5 種溶液各 10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰出現，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.VerbascosideA.Reference solution B-C.Test solution（oral liquid and tablets，respectively） D- E.Negative reference solution（oral liquid and tablets，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：考察口服液時，精密吸取質量濃度為14.36 μg/ mL 的對照品溶液1，2，4，6，8，10，15 μL；考察片劑時，精密吸取質量濃度為71.8 μg/mL 的對照品溶液1，2，4，6，8，10，15，20 μL，分別按2.1 項下色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y口= 1.22 ×106X口+ 1 730（r= 0.999 0，n= 7）和Y片= 1.21 ×106X片+60 200（r=0.995 0，n=8）。結果表明，口服液和片劑中毛蕊花糖苷的進樣量分別在0.013 6～0.203 4 μg和0.067 8～1.355 7 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液（質量濃度為14.36 μg/mL）10 μL，按2.1項下色譜條件重復進樣測定6 次，記錄峰面積。結果的RSD為1.21%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取2.2 項下供試品溶液（口服液、片劑）各 20 μL，分別于0，4，8，12，16，20，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果口服液和片劑的RSD分別為1.12%和1.27%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：精密量取同一批口服液，取同一批片劑，精密稱定，分別依法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算含量。結果口服液和片劑中毛蕊花糖苷的平均含量分別為10.90 μg/mL 和113.74 μg/ g，RSD分別為0.99%和1.94%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：考察口服液時，精密量取已知含量的供試品溶液（含毛蕊花糖苷10.90 μg/ mL）6 份，各3 mL，置10 mL容量瓶中；考察片劑時，取已知含量的供試品溶液（含毛蕊花糖苷113.74 μg/ g）6 份，各1.5 g，精密稱定，分別精密加入質量濃度為35.9 μg/mL 的毛蕊花糖苷對照品溶液1 mL 和5 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算回收率。結果見表1。

表1 毛蕊花糖苷加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of recovery test of verbascoside（n=6）

耐用性試驗：分別采用不同品牌及型號的高效液相色譜儀（島津2030C-3D型、Agilent 1260 Infinity Ⅱ型），以及不同品牌的色譜柱［Agilent 5TC - C18柱、Shiseido Spolar C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）］，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果樣品中的待測定峰均分離完全，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

共抽取4 個省份、8 家不同生產企業的樣品（65 批口服液、5批片劑），按2.1項下色譜條件進樣測定，計算毛蕊花糖苷的含量。結果5批片劑中毛蕊花糖苷的含量為0.11～0.27 mg/ g，平均為0.22 mg/ g；口服液中含量測定結果見表2。可見，不同生產企業的樣品中毛蕊花糖苷含量有不同程度的差異，部分生產企業含量高，但集散程度較大，產品批間差異大，說明該生產企業在原料藥和生產工藝的控制方面的水平不穩定。

表2 8家生產企業的杞菊地黃口服液中毛蕊花糖苷含量測定結果Tab.2 Results of content determination of verbascoside in Qiju Dihuang Oral Liquid of eight manufacturing enterprises

3 討論

3.1 提取條件選擇

在供試品溶液的制備中分別以乙醇、50%甲醇、甲醇為溶劑，結果以甲醇為溶劑時測定的含量最高；考察了片劑加熱回流提取及超聲提取2種提取方法，結果采用加熱回流提取時測定的含量最高。

3.2 色譜條件選擇［8-15］

以甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.1%甲酸按一定比例混合作為流動相，結果以乙腈-0.1%甲酸溶液（15∶85，V/V）為流動相時雜質峰較少，基線平穩，分離度較好；在其余條件不改變的前提下，改變柱溫（25，30，35，40 ℃），結果柱溫為30 ℃時目標峰與相鄰峰間分離度最佳。故最終確定2.1 項下色譜條件，供試品溶液的峰形較好，分離度符合要求。

3.3 指標性成分選擇

熟地黃為玄參科植物地黃的炮制加工品，味甘，微溫，歸肝、腎經，具有填精補腎、滋養陰血功效，通過配伍可實現真精與氣、血、陰、陽的互化，視為五臟六腑之藥，熟地黃及其活性成分在血液、內分泌、心血管、免疫、神經系統均有廣泛的藥理學作用［16-17］，在杞菊地黃制劑中為處方量最大的一味藥。取生地黃藥材，照《中國藥典》方法自行炮制熟地黃，分析炮制過程中不同階段地黃的含量，結果毛蕊花糖苷的含量在炮制過程中并未發生明顯變化，故其可作為評價熟地黃飲片及含熟地黃成分的制劑質量優劣的指標性成分之一。

3.4 方法評價

本方法操作簡單，結果準確，重復性好，可用于測定杞菊地黃制劑中毛蕊花糖苷的含量。