黃梔祛傷水質量標準研究*

朱 芹 ，趙 娟 △，謝宏贊 ，王 興 ，羅純清

（1. 湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411000； 2. 湖南省湘潭市中醫醫院，湖南 湘潭 411000）

黃梔祛傷水為湖南省湘潭市中醫醫院的醫院制劑，由黃連、黃柏、大黃、梔子、牡丹皮、紅花、乳香、沒藥、薄荷、白礬10 味中藥組方，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛功效，主治肢體損傷、腫脹疼痛伴灼熱、紅腫者。方中大黃、黃連、黃柏、梔子清熱燥濕、瀉火解毒，為君藥［1-3］；牡丹皮清熱涼血，乳香、沒藥活血消腫、化瘀止痛，紅花活血化瘀，共為臣藥［4-5］；薄荷、白礬疏散解表、透疹行氣、燥濕止癢、解毒殺蟲，為佐藥［6-7］。該方參考清代吳鞠通的《溫病條辨》擬訂，經多年臨床實踐驗證，目前正在申報醫院制劑批準文號，但尚無質量標準。為了全面、有效地控制黃梔祛傷水的質量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中黃連、黃柏、大黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定方中鹽酸小檗堿、梔子苷、丹皮酚的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

E2695型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），配有2998型二極管陣列檢測器、2695型自動進樣器、Empower3色譜工作站；ABS-135S 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；明澈-D24UV純水/超純水一體化系統（德國默克密理博公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

黃梔祛傷水（湖南省湘潭市中醫醫院制劑室，批號分別為 20210106，20210211，20210325，規格為每瓶500 mL）；梔子苷、丹皮酚、鹽酸小檗堿對照品（批號分別 為 110749 - 201919，110708 - 201908，110713 -202015，純度分別為97.1%，99.8%，85.9%），黃連、黃柏、大黃對照藥材（批號分別為120913 - 201310，121510 - 201807，120902 - 201912），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

黃連［8］：取樣品 20 mL，加甲醇100 mL，超聲提取（功率為500 W，頻率為40 kHz）30 min，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。另取黃連對照藥材0.25 g，同法制成對照藥材溶液。按黃梔祛傷水處方工藝制備缺黃連的陰性樣品，取5 mL，同法制成缺黃連藥材的陰性對照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（30∶35∶10∶15∶5∶10，V/V/V/V/V/V）為展開劑，置濃氨試液預飽和20 min 的展開缸內，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

黃柏［9］：取樣品30 mL，加1%醋酸甲醇溶液200 mL，于60 ℃溫度條件下超聲提取（功率為400 W，頻率為40 kHz）40 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.5 g，加1%醋酸甲醇溶液50 mL，同法制成對照藥材溶液。按黃梔祛傷水處方工藝制備缺黃柏藥材的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（30∶15∶4，V/V/V）的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖1.Reference medicinal material solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Coptidis Rhizoma（365 nm） B.Phellodendri Chinensis Cortex（sunlight） C.Rhei Radix et Rhizoma（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

大黃［10］：取樣品20 mL，加甲醇100 mL，超聲提取（功率為400 W，頻率為40 kHz）40 min，濾過，取濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分2 次振搖提取，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液。按黃梔祛傷水處方工藝制備缺大黃藥材的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）- 甲酸乙酯 - 甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同的橙黃色熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters Xterra C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.25%磷酸溶液（B），梯度洗脫［11-14］（程序見表1）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：238 nm（梔子苷）和274 nm（鹽酸小檗堿和丹皮酚）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖2。理論板數以梔子苷峰計大于5 000，各待測成分與前后峰分離度均大于1.5。

圖2 高效液相色譜圖1.Geniposide 2.Berberine hydrochloride 3.PaeonolA.Mixed reference solution B.Test solution C-E.Negative control solution（lacking of Coptidis Rhizoma，Gardeniae Fructus and Moutan Cortex，respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品24.29 mg、梔子苷對照品12.65 mg 及丹皮酚對照品20.07 mg，精密稱定，置同一50 mL 棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，即得混合對照品溶液（室溫避光保存，備用）。取裝量差異項下樣品，混勻，精密量取20 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率為400 W，頻率為50 kHz）40 min，放冷，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方工藝，分別制備缺黃連、梔子、丹皮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法分別制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察、檢測限與定量限確定：分別精密吸取 2.2.2 項下混合對照品溶液 4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0 mL，置同一20 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚質量濃度分別為0.485 8，0.253 0，0.401 4 mg/mL的系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。將對照品溶液逐級稀釋，以信噪比（S/N）為3.0時的質量濃度為各成分的檢測限，以S/N為10.0 時的質量濃度為各成分的定量限。結果見表2。

表2 線性關系考察、檢測限與定量限確定結果（n=6）Tab.2 Results of linear relationship test，LOD and LOQ（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液10 μL，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚峰面積的RSD分別為0.55%，0.62%，0.71%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為20210106）樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于常溫下放置0，3，6，9，15，20，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚峰面積的RSD分別為1.25%，0.94%，1.03%（n=7），表明供試品溶液在常溫下24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20210106）樣品6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算質量濃度。結果鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的平均質量濃度分別為1.187 0，0.674 1，0.820 7 mg/ mL，RSD分別 1.24%，0.96%，0.89%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20210106）9 份，分為 3 組，各 3 份，每份精密量取 10 mL，每組按供試品中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚含量的80%，100%，120%精密加入相應對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.3 Results of recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算樣品中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的含量。結果見表4。

表4 3批樣品含量測定結果（mg/mL，n=3）Tab.4 Results of content determination of ingredients in the three bacthes of samples（mg/mL，n=3）

3 討論

3.1 TLC 條件選擇

對黃連、黃柏、大黃進行定性鑒別時，分別考察了不同品牌（青島海洋、上海邦凱）的薄層板、不同溫度（室溫、2～10 ℃）、相對濕度（40%，50%～60%，75%）條件下展開的效果，以及不同檢視方式（日光、紫外光燈）的顯色效果，最終確定為2.1項下TLC條件。

3.2 色譜條件選擇

為保證各成分在各自最佳吸收波長處被檢測到，并達到同時檢測3種有效成分的目的，采用二極管陣列檢測器于190～400 nm 波長范圍內測定混合對照品溶液和供試品溶液，最終確定采用分段變換波長檢測，在238 nm 波長處檢測梔子苷，在274 nm 波長處檢測鹽酸小檗堿及丹皮酚。分別考察了不同洗脫體系（乙腈-水、乙腈- 磷酸溶液、甲醇- 水、甲醇- 磷酸溶液），以及不同梯度、不同比例的洗脫條件，不同柱溫（25，30，35 ℃），不同品牌色譜柱（Waters Xterra C18柱、Agilent Zorbax C18柱、Ultimate XB-C18柱），不同濃度提取溶劑（甲醇、50%甲醇、80%甲醇），不同提取時間（35，40，45 min）的提取效果，最終確定為2.2.1項下色譜條件。

3.3 指標性成分選擇

參照2020 年版《中國藥典（一部）》［15］中單味中藥的質量標準，黃連和黃柏、梔子、牡丹皮的指標性成分分別為鹽酸小檗堿、梔子苷、丹皮酚，故確定采用高效液相色譜法同時測定3種化學成分，以控制黃梔祛傷水的質量。由表4 可知，3 批樣中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的平均含量分別為1.180 7，0.675 6，0.823 2 mg/mL，將其平均值的70%作為含量測定下限值，初步擬訂黃梔祛傷水中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的含量限度分別為0.83，0.47，0.58 mg/mL。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便，結果準確，靈敏度高，重復性好，擬訂的質量標準為控制黃梔祛傷水的質量提供了參考。