高效液相色譜法同時測定口瘡穴位貼中3 種生物堿含量*

董文燊 ，周秋娟 ，林 芝 ，陳 穎 ，蔣 燕 ，李 逸 ，瞿發(fā)林 △

（1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院，江蘇 常州 213003； 2. 江蘇省常州市武進區(qū)中西結(jié)合醫(yī)院，江蘇 常州 213003）

口瘡穴位貼方源自中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院中藥復方經(jīng)驗方口瘡散，由生大黃、吳茱萸、細辛、肉桂、川黃連5 味中藥組方［1］，具有溫通經(jīng)絡、清熱瀉火、散寒止痛功效，主要用于治療口腔潰瘍。方中，大黃、黃連味苦，性寒，清熱瀉火，用于上焦、中焦實火上炎；吳茱萸、細辛、肉桂為溫里藥，用于浮越之火引火歸元，導熱下行，吳茱萸的主要活性成分包括吳茱萸堿和吳茱萸次堿，具有散寒止痛功效；川黃連為苦寒之藥，主要活性成分為小檗堿，具有清熱瀉火功效。為了更好地控制口瘡穴位貼的質(zhì)量，保證其臨床療效，本研究中建立了同時測定其主要活性成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿含量的高效液相色譜法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SIL - 20A 型自動進樣器、SPD - M20A 型檢測器；FA1004型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）；XS105 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為萬分之一）；R201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；HHS型恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）。

1.2 試藥

口瘡穴位貼（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院常州醫(yī)療區(qū)制劑室自制，批號分別為20210118，20210120，20210122）；吳茱萸堿對照品（批號為110802-201710，含量按99.6%計），吳茱萸次堿對照品（批號為110801-201608，含量按99.7%計），小檗堿對照品（批號為110713 - 201814，含量按86.7%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；十二烷基硫酸鈉（SDS，湖南爾康制藥股份有限公司，批號為101420190415）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrosphe C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.015 mol/L SDS水溶液（20∶35∶45，V/V/V）；流速：1.0 mL/ min；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿對照品各適量，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解成每1 mL分別含吳茱萸堿 86.05 μg、吳茱萸次堿 46.58 μg 和小檗堿36.69 μg的混合對照品溶液。

取口瘡穴位貼5貼，除去包裝及蓋襯，刮取藥膏，置研缽中，混勻，取1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz）40 min使溶解，放至室溫，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取濾液10 mL，置圓底燒瓶中減壓蒸干，殘渣加熱水（70～80 ℃）10 mL，超聲使溶解，用 0.1 mol/ L NaOH 調(diào) pH 至 8.5，分別用 20，10，10 mL 二氯甲烷萃取3 次，合并萃取液，減壓蒸干，殘渣少量多次用甲醇超聲（功率為300 W，頻率為50 kHz）使溶解，置 10 mL 容量瓶中，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

按處方工藝分別制備缺吳茱萸、川黃連藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Evodiamine 2.Rutecarpine 3.BerberineA.Mixed control solution B.Test solution C.Negative control solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：采用自動進樣器分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of linear relationship test（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定5次，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿峰面積的RSD分別為1.40%，1.67%，1.71%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20210118）口瘡穴位貼藥膏5 份，各1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿含量的RSD分別為1.36%，1.63%，1.76%（n= 5），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按 2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿峰面積的RSD分別為1.29%，1.60%，1.70%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取口瘡穴位貼藥膏適量，精密稱定，按1∶1 精密加入含吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的混合對照品溶液適量，加甲醇至刻度，平行制備6份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3 批口瘡穴位貼藥膏1 g，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定2 次，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果樣品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的平均含量分別為 1.182 6，0.583 8，2.078 9 mg/ g。詳見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=2）Tab.3 Results of content determination of samples（n=2）

3 討論

3.1 流動相選擇

比較了以甲醇- 乙腈- 0.015 mol/ L SDS 水溶液和乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液為流動相［2-5］時3 種待測成分的峰形及分離度，結(jié)果前者優(yōu)于后者。調(diào)節(jié)甲醇- 乙腈- 0.015 mol/ L SDS 水溶液洗脫體系的比例為20∶35∶45（V/V/V）時，3 種待測成分的分離度高，峰形好，干擾少。故選擇甲醇-乙腈-0.015 mol/L SDS水溶液（20∶35∶45，V/V/V）作為流動相。

3.2 檢測波長選擇［3］

采用紫外- 可見光掃描對照品溶液，結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿于225 nm 和290 nm 波長處均有較大吸收，小檗堿于225，265，346 nm 波長處均有較大吸收；但供試品溶液于225 nm 波長處基線平穩(wěn)度較差，且其他色譜峰亦有較大吸收，影響小檗堿峰的分離度，于265 nm 和290 nm 波長處3 種生物堿成分的分離度均較好，但265 nm 波長處的吸收值高于290 nm，故選擇265 nm作為3種待測成分的檢測波長。

3.3 萃取溶劑選擇

口瘡穴位貼由5味中藥飲片經(jīng)粉碎后入藥，化學成分復雜。預試驗中采用甲醇超聲提取，本研究中采用有機溶劑進行提取與純化，曾以乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚作為供試品的萃取溶劑。結(jié)果二氯甲烷對吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的綜合萃取率較高，故選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

3.4 供試品溶液pH 調(diào)節(jié)點選擇

小檗堿的溶解度在稀堿溶液中提高［6-7］。本研究中采用0.1 mol/ L NaOH 溶液調(diào)節(jié)供試品溶液的pH 值（范圍為7.5～9.0），對吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的萃取率進行考察。結(jié)果吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的萃取率由大至小分別為pH 8.5>pH 7.5>pH 9.0>pH 8.0，pH 7.5 > pH 8.5 > pH 8 > pH 9.0，pH 9.0 >pH 8.5>pH 7.5>pH 8.0。綜合比較，最終以pH 8.5作為供試品溶液的pH調(diào)節(jié)點。

3.5 方法評價

本方法操作簡便快速、重復性好、結(jié)果準確，可用于同時測定口瘡穴位貼中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和小檗堿的含量。