肖新生,張 慎,袁 芳,李佳穎
1.湖南科技學院化學與生物工程學院,湖南省永州市零陵區楊梓塘路130號 425199 2.湖南省煙草公司永州市公司,湖南省永州市冷水灘區珍珠北路69號 425100
擬除蟲菊酯是文菊花中天然成分除蟲菊酯的合成類似物。擬除蟲菊酯類農藥作為一類廣譜的殺蟲劑,1948年由美國農業部實驗室人工合成。新開發的擬除蟲菊酯類農藥具有使用濃度低、觸殺作用強、滅蟲速度快、殘效時間長及安全系數高等優點,是殺蟲劑農藥的一個新的突破。調查發現,我國煙草中害蟲有200余種,病害有68種,嚴重影響了煙草生產安全[1]。為了保障煙草質量,使用化學農藥防治是目前最有效的手段。擬除蟲菊酯類農藥對煙草多種害蟲,如桃食心蟲類、尺嫂類、扇舟蛾類、卷葉蛾類等,均有較好的防治效果。盡管過去一直認為擬除蟲菊酯類農藥在人體內易被氧化酶系統降解,無蓄積性,是低毒性的農藥[2]。但后續研究資料表明,如果長期接觸,即便是低濃度的接觸,也會對人體免疫系統、神經系統以及血液循環系統等產生不利影響[3-4]。
為了保障煙草制品的質量安全,國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)于2021年提出了包含10種擬除蟲菊酯類在內的117種農藥在煙草中的指導性殘留限量(Guidance residue limits,GRLs)(表1)。歐美等國家和地區也制定了煙草中包含擬除蟲菊酯類在內的農藥最大殘留限量(Maximum residue limits,MRLs)。由于氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等在煙草生產中的廣泛使用,其殘留也是每年煙草公司質量抽檢的必檢項目。因此,開展煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留分析具有重要的意義。

表1 煙草中擬除蟲菊酯類農藥種類及指導性殘留限量①Tab.1 Species and guidance residue levels of pyrethroid pesticides in tobacco
目前,關于食品或環境中擬除蟲菊酯類農藥殘留量分析方法的報道較多,但由于煙草成分復雜,干擾成分多,這些方法并不能完全適用于煙草中擬除蟲菊酯類殺蟲劑殘留的分析。盡管已經制定了煙草中有機氯和擬除蟲菊酯類農藥檢測的行業標準,但是在實際使用過程中,還存在干擾因素多、定量不準、分析時間長、假陽性多等問題。因此,科研工作者對擬除蟲菊酯類農藥分析方法在煙草中的應用情況進行了持續深入的研究,為便于廣大相關科研人員根據現有條件合理地選擇煙草及其制品中擬除蟲菊酯類農藥殘留量的分析方法,現將有關文獻報道情況進行歸納總結。
目前,擬除蟲菊酯的分析方法主要有氣相色譜-電子捕獲檢測器法(Gas chromatography-Electron capture detector,GC-ECD)、氣相色譜-質譜聯用法(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)、氣相色譜-串聯質譜法(Gas chromatography-Tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)、液相色譜-串聯質譜法(Liquid chromatography-Tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)等。有關擬除蟲菊酯分析檢測的綜述已有較多報道[5-11],而有關煙草中農藥殘留分析檢測的綜述也有少量報道[1,12],但有關煙草中擬除蟲菊酯檢測方法的綜述鮮見報道。以下對煙草中擬除蟲菊酯殘留幾種主要的分析方法進行歸納,對比各分析方法的特點。
目前,分析煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留量最主要的方法是GC法,并采用電子捕獲檢測器(ECD)。由于GC-ECD法對含電負性基團的分子具有較高的靈敏度,在有機氯、擬除蟲菊酯和其他含電負性原子的農藥殘留分析中應用廣泛。煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留檢測和農藥降解規律研究的論文也大多選擇該方法。煙草中擬除蟲菊酯農藥殘留量測定的行業標準(YC/T 405.2—2011[13])也采用GC-ECD方法。通過對相關文獻的對比分析發現,研究對象既有鮮煙葉[14-19],也有干煙葉和成品煙[13,20-29];有多種農藥的殘留分析[13,15,21-24,27-31],也有單種農藥的殘留分析[14,16-20,25,32]。不同文獻中檢測方法的差異主要表現在前處理方面;其次在色譜條件的優化方面也有所不同,特別是色譜柱的選擇。
GC-ECD法檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥的前處理對測定結果影響非常大,不恰當的前處理導致雜質干擾目標農藥的定性定量分析。前處理一般均需經過提取和凈化兩個步驟。在提取步驟中,主要涉及的關鍵點為提取方法和提取溶劑的選擇。目前,文獻所涉及的主要提取方法及特點如表2所示。對于鮮煙葉中擬除蟲菊酯的提取,大多文獻中采用了組織搗碎勻漿法[15-16,18-19]。對于干煙葉中擬除蟲菊酯的提取,早期文獻中報道的是索氏提取法[18-19],其后逐漸發展了機械攪拌提取[31,33]、渦旋振蕩提取[21,34]、超聲波輔助提取[13,20,23,25-27,29]和Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe(QuEChERS)提取[22]等方法。

表2 GC-ECD法檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留提取方法比較Tab.2 Extraction methods of pyrethroid pesticide residues in tobacco by GC-ECD method
提取溶劑是另一個關注的熱點問題,常采用的提取溶劑有丙酮[17-19,25,28-29,33-34]、丙酮-水[15,27,31]、乙腈-水[16,32]、石油醚[18-19,22]、環己烷[24,26]、石油醚-丙酮[14,20,25]、乙酸乙酯-正己烷[13,21,23]。早期的文獻中也有用丙酮提取后,接著采用石油醚對煙葉再次進行提取的報道[17,28-29,33];用乙腈提取后再用正己烷萃取乙腈提取液的方法也有報道[30]。喻學文[22]對QuEChERS方法中的提取溶劑乙腈和石油醚進行了比較,而石杰等[26]比較了環己烷、二氯甲烷、環己烷-乙酸乙酯等不同極性的有機溶劑或混合溶劑作為提取溶劑的提取效果,結果如表3所示。從表3的對比結果可以看出,采用非極性溶劑,提取效率較高。

表3 GC-ECD法檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留提取溶劑比較Tab.3 Extraction solvents of pyrethroid pesticide residues in tobacco by GC-ECD method
GC-ECD法檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥的前處理凈化步驟中,主要采用的方法有填充玻璃凈化柱分離、固相萃取小柱(Solid phase extraction,SPE)分離及凝膠色譜分離。采用填充玻璃凈化柱凈化時,一般在玻璃凈化柱子兩端各裝2 g左右的無水硫酸鈉,在中間裝入15 g左右的弗羅里硅土或硅酸鎂
吸附劑,洗脫劑可以采用不同比例的丙酮-正己烷或乙酸乙酯-石油醚混合溶劑。該方法操作相對繁瑣,現逐漸被SPE技術所取代。目前,SPE有弗羅里硅土(Florisil)固相萃取小柱[13,22-23,26,31]、C18固相萃取小柱[14,25]、硅膠固相萃取小柱[20]、二元石墨化碳-氨基復合固相萃取小柱(PestiCarb-NH2,PC-NH2)和三元茶葉專用固相萃取小柱(Triple phase SPE for tea,TPT)[21]等。弗羅里硅土主要成分為硅酸鎂,是具有弱堿性的硅酸鹽吸附劑,主要吸附去除有機酸和強極性干擾物。氨基與弗羅里硅土類似,可以去除有機酸和部分色素等極性干擾物。C18可以去除脂類,而石墨化碳可以去除色素和部分芳香物質。Dattilo等[31]采用Florisil固相萃取小柱對煙草提取物進行凈化,使用GC-ECD同時測定了煙草中8種擬除蟲菊酯類農藥。李櫻等[30]對比了Florisil固相萃取小柱和大型Florisil硅土柱,石杰等[26]采用V環己烷∶V二氯甲烷=80∶20的混合溶劑為洗脫劑對比了硅膠柱和Florisil柱兩種正相柱的凈化效果,宋春滿等[21]比較了Florisil單一填料、PC-NH2二元復合填料和TPT三元復合填料3種固相萃取小柱對煙草樣品的凈化效果,結果如表4所示。

表4 GC-ECD法檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留的凈化柱效果比較Tab.4 Purification column effects of GC-ECD method for determination of pyrethroid pesticide residues in tobacco
凝膠滲透色譜(Gel permeation chromatography,GPC)是利用不同體積的分子在多孔性凝膠中運動的路徑長短不一,大分子(例如油脂、色素、生物堿、聚合物等)由于不能進入細微結構,先被淋洗出來,而農藥等小分子的運動路徑長,在凝膠柱中停留的時間長,后被淋洗出來。GPC在動物性食品復雜樣品分析的前處理中應用廣泛,因此也可應用于煙草等復雜基質中農藥殘留分析的凈化。方敦煌等[15]采用GPC對煙草提取物進行凈化,探討了煙草中7種擬除蟲菊酯農藥在GPC柱上的流出規律。由于GPC價格比較昂貴,劉躍華等[27]采用普通的聚苯乙烯凝膠柱對其進行替代后,應用于煙草提取物中溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和S-氰戊菊酯的凈化處理,在GC-ECD檢測中取得了與GPC近似的凈化效果。
凝結法通過將煙葉組織中提取出來的各種復雜干擾物轉化為沉淀物,也應用在煙草擬除蟲菊酯類農藥GC-ECD檢測前處理中。呂靜等[33]、張雪燕等[34]分別將煙葉樣品用丙酮提取后,再用石油醚萃取,然后用H3PO4-NH4Cl溶液凝結,最后分別采用填充弗羅里硅土和硅膠的玻璃柱進行層析凈化,分別建立了煙草中6種擬除蟲菊酯類農藥殘留量的檢測技術。喻學文[22]研究發現,QuEChERS前處理步驟中,在加入硫酸鎂和N-丙基乙二胺吸附劑(N-Propyl ethylenediamine adsorbent,PSA)凈化之前,對溶解了農藥的煙葉樣品提取液進行15~20 min冷卻處理,可使GC-ECD檢測中擬除蟲菊酯類農藥色譜峰的分離度更高。
在GC-ECD分析檢測步驟中,主要涉及色譜柱的選擇和分析條件的優化等。色譜柱選擇上,早期采用填充柱,如呂靜等[33]采用填充3%(質量百分比,下同)的OV-101(3%聚二甲基硅氧烷-101)+3%APIEZON L(阿皮松L)+94%Gas chrom Q(硅藻土型色譜載體Q)固定相的玻璃柱,實現煙草中6種擬除蟲菊酯類農藥的分離。近年來,填充柱逐漸被毛細管柱所取代,毛細管柱內壁通過化學鍵鍵合的固定相主要有(5%苯基)甲基聚硅氧烷(對應色譜柱型號:DB-5[26]、HP-5[20])、(14%氰丙基苯基)甲基聚硅氧烷(對應色譜柱型號:DB-1701[30])等。ECD檢測器對于載氣的純度要求較高,一般采用高純氮氣作為載氣,要求純度>99.999%。也有文獻報道采用高純氫氣[28]或高純氦氣[21,26]作為載氣的。對于擬除蟲菊酯類農藥的分析,GC-ECD的檢測限常可低至0.001~0.014 mg/kg[13],靈敏度比GC-MS法高出10倍以上;而其不足之處為定性能力較差,導致假陽性比較嚴重,需要用另一根不同極性的色譜柱或者采用GC-MS進行驗證。
GC-MS法具有色譜的高效分離和質譜的準確定性定量能力,在擬除蟲菊酯類農藥檢測中應用廣泛[35-40]。同時,GC-MS法在煙草中農藥殘留檢測、風味成分的檢測、活性成分的檢測等方面也有廣泛應用[41-46]。而有關GC-MS法在煙草中擬除蟲菊酯農藥分析中的應用也有文獻報道。
從現有文獻看,既有單種農藥殘留的分析[47],也有多種農藥殘留的分析[48-53]。在前處理過程中,陳雪等[47]采用填充了弗洛里硅土的玻璃柱進行凈化,洪蓮等[48]采用氣流式微注射器萃取技術(Gas purge microsyringe extraction,GP-MSE)對煙草中6種擬除蟲菊酯類農藥進行萃取、濃縮和凈化。Gao等[49]采用改進的QuEChERS方法,以乙腈-飽和鹽水兩相體系作為萃取劑,PSA作為凈化劑,無需經過固相萃取柱,可以直接上機分析。牟定榮等[50]以超聲波輔助乙腈萃取煙草中的擬除蟲菊酯類農藥,然后采用C18固相萃取小柱凈化。曹建敏等[51]建立了包含6種常用擬除蟲菊酯在內的煙草中40種農藥的固相萃取GC-MS分析法。煙草樣品用乙腈提取后,經TPT固相萃取小柱凈化,然后采用GC-MS進行分析。Hou等[52]在前處理過程中采用攪拌棒吸附萃取技術(Stir bar sorptive extraction,SBSE)提取煙草中的5種擬除蟲菊酯,然后采用熱脫附系統將提取的物質熱脫附后進行分析。Shen等[53]以水作為萃取劑,采用超聲波輔助固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)進行前處理,以涂有聚二甲基硅氧烷的纖維膜作為固相萃取膜,整個前處理過程僅包含超聲波輔助提取和固相微萃取步驟,所需總時間<15 min。
GC-MS分析煙草中農藥殘留時,全掃描模式因靈敏度和選擇性差沒有被采用。選擇離子掃描模式(Selective ion monitoring,SIM)在GC-MS檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留的靈敏度和選擇性可以滿足要求,例如牟定榮等[50]、曹建敏等[51]、Hou等[52]和Shen等[53]均報道了相應方法。馮義志等[54]比較了GC-ECD、GC-EI-MS和GC-NCI-MS 3種不同檢測方法測定煙草中氟氯氰菊酯的靈敏度,發現GC-ECD法的響應值高,選擇性差,對凈化要求高;GC-EI-MS法的響應值一般,但選擇性強,基本無雜質干擾;GC-NCI-MS的響應值較高,選擇性強,基本無雜質干擾。
采用GC-MS法分析煙草中農藥殘留時,方法的最低檢測限、加標回收率和RSD數據如表5所示。可以看出,大部分文獻報道的檢測限、加標回收率和RSD均能夠滿足農藥殘留檢測的要求。曹建敏等[51]采用GC-MS法對煙草中6種常用擬除蟲菊酯農藥進行分析時還發現,基質效應特別明顯。

表5 GC-MS法檢測煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留的檢測限、加標回收率及RSDTab.5 Limits of detection,spiked recoveries and RSDs of pyrethroid pesticide residues in tobacco by GC-MS method
因為GC-MS法單級質譜定量檢測的靈敏度相對較低,同時在定性過程中容易出現假陽性,所以具有更高靈敏度和選擇性的GC-MS/MS技術逐漸受到重視,成為農藥殘留分析的主流方法之一。GC-MS/MS法在擬除蟲菊酯類農藥殘留分析方面的應用有不少文獻報道[55-62],我國也制定了GC-MS/MS測定擬除蟲菊酯類農藥殘留的相關標準。近年來,將GC-MS/MS法應用到煙草中擬除蟲菊酯類多種農藥殘留檢測也有文獻報道。Haib等[63]建立了一種以丙酮作萃取劑,利用加壓溶液萃取技術提取農藥,采用GC-MS/MS法分析煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留的新方法;同時還對比了三重四極桿EI離子源GC-MS/MS、負化學電離源GC-MS與帶熒光檢測器的HPLC法檢測農藥的靈敏度和選擇性。Lee等[64]也采用GC-MS/MS技術分析了包含氟氯氰菊酯、氯菊酯、氟氰戊菊酯、溴氰菊酯在內的煙草中49種農藥殘留,發現采用選擇反應監控模式,氣相色譜的分離效果對檢測結果分析影響不大,農藥殘留的最低檢測限在0.004~0.039μg/mL之間;該研究中還比較了前處理方法中所采用的PSA、C18柱、石墨化碳3種吸附材料,結果表明,采用QuEChERS法,以PSA為吸附劑,結合基質配標,測定結果的回收率和重復性最好。Cochran[65]將二維氣相色譜-飛行時間質譜(GC×GC-TOF-MS)法用于煙草中有機氯、有機磷和擬除蟲菊酯類農藥的殘留分析,效果也較好。陳曉水等[66]采用GC-MS/MS法測定煙草中包含擬除蟲菊酯的132種農藥殘留,所測農藥的定量限均低于0.02 mg/kg,平均回收率為68.10%~123.15%,RSD為1.79%~19.88%。陳黎等[67]采用GC-MS/MS測定高效氯氟氰菊酯和氰戊菊酯的方法,系統研究了煙草農藥殘留在大田生長期及加工過程中的變化規律。樓小華等[58]建立了煙草中包含擬除蟲菊酯類在內的113種農藥殘留的GC-MS/MS分析方法,通過色譜柱的選擇、分析參數的優化,實現了快速準確的分析。將與GC串聯的ECD、MS、MS/MS 3種檢測器在煙草中擬除蟲菊酯殘留測定的應用情況進行對比,結果如表6所示。

表6 GC-ECD、GC-MS、GC-MS/MS法測定煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留的特點Tab.6 Characteristics of GC-ECD,GC-MSand GC-MS/MSmethods in determination of pyrethroid pesticide residues in tobacco
HPLC法具有高效的分離能力,廣泛應用于檢測分子量大、沸點高、受熱不穩定的化合物。郭衛蕓等[68]采用配備了二極管陣列檢測器(Photo-diode array,PDA)的超高效液相色譜儀,實現了煙草中溴氰菊酯和氣相色譜法不能檢測的四溴菊酯的同時分析,結果表明,在6.5 min內可以完成對四溴菊酯和溴氰菊酯殘留量的分析,定量限分別為0.33和0.23 mg/kg。雖然HPLC法已在煙草農藥殘留檢測中有應用,但是常用檢測器(如紫外分光光度計、折光儀、蒸發激光光散射儀等)對擬除蟲菊酯類農藥檢測的靈敏度還有待進一步提高。靈敏度較高的熒光檢測器要求樣品必須帶有熒光基團,而擬除蟲菊酯等大多數農藥分子中沒有發光團,不能直接用HPLC法檢測,因此,能采用HPLC檢測的農藥種類相對較少。
采用LC-MS/MS法進行樣品分析時,樣品混合物需先經高效液相色譜進行分離,然后進入質譜儀,在多反應監測(Multiple reaction monitoring,MRM)模式下進行定性定量分析。該方法具有較強的選擇性和靈敏度,可對極性相對較大的農藥分子進行有效分離和定性定量分析,且對柱分離效果要求不高,在農藥殘留分析中應用廣泛。GB/T 20769—2008[69]中,采用LC-MS/MS法同時測定水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品,其中只包含胺菊酯、生物丙烯菊酯和生物芐呋菊酯3種極性相對較大的擬除蟲菊酯類農藥。YC/T 405.1—2011[70]中規定了73種農藥的HPLC-MS/MS分析方法,但不包含擬除蟲菊酯類農藥。穆小麗等[71]探索了采用LC-MS/MS法測定煙草樣品中擬除蟲菊酯農藥殘留量的方法,通過對分析條件的優化,發現流動相體系對分析檢測的靈敏度影響非常大;采用LC-MS/MS法最常用的乙腈-水流動相體系,氯菊酯和溴氰菊酯的靈敏度低,甲氰菊酯、氯氰菊酯和氟胺氰菊酯未檢出;而采用V甲醇∶V水∶V乙酸銨=98∶2∶0.1混合液作流動相時,氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯和溴氰菊酯的檢出限可低至0.000 5~0.005 0 mg/kg,色譜峰形好,平均加標回收率、RSD等符合大量樣品快速檢測的要求。廖雅樺等[72]采用凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯質譜法測定了煙草中包含氟胺氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯5種擬除蟲菊酯在內的50種農藥殘留量;HPLC分析的流動相為V甲醇∶V水∶V乙酸=98∶2∶0.002,擬除蟲菊酯類農藥的檢測限為0.007~0.010 mg/kg,加標回收率為85%~108.5%,RSD為2.5%~10%。周曉峰[73]采用高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱組合式高分辨質譜測定了包含高效氯氟氰菊酯在內的6種農藥在煙草中的殘留量,高效氯氟氰菊酯的檢測限為0.002 mg/kg,加標回收率為76.4%~95.1%,RSD為7.6%~9.0%。從現有文獻報道看,LC-MS/MS法檢測的煙草中擬除蟲菊酯的種類不足以包含煙草中需要檢測的種類,因此該方法的推廣應用受到制約。
除了上述分析檢測方法外,對煙草中擬除蟲菊酯農藥殘留的分析還有免疫分析法[74]、生物測定法[75]、電化學傳感器法[76]、薄層色譜法[77]等。如劉媛等[74]研究了酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)在煙草中高效氯氟氰菊酯殘留分析中的應用情況,建立了加標基質液的ELISA檢測標準曲線,對50個施藥后的烤煙煙草樣品同時采用ELISA法和氣相色譜法(具體為GC-ECD)進行對比分析,結果表明,ELISA法檢測樣本陽性檢出率為34%,而GC-ECD法的檢出率為22%。與GC法相比,盡管ELISA法的假陽性率為12%,但是其假陰性率為0,所以該方法常應用于進行大量煙草樣本中氯氟氰菊酯殘留量的快速篩查。Apostolou等[76]采用電化學生物傳感器檢測煙草樣品中擬除蟲菊酯,發現該生物傳感器能夠不受煙堿和煙葉其他生物堿的影響,煙草中低至1.5 mg/kg的氯氰菊酯均可檢出。
綜上所述,對煙草中擬除蟲菊酯類農藥的檢測已經發展了較多的方法和技術,其中以GC-ECD法應用最為廣泛,GC-MS/MS和GC-MS法的應用也有一定量的文獻報道,HPLC和LC-MS/MS法的文獻報道較少。整體上,HPLC和LC-MS/MS法的檢測靈敏度不高,影響了其應用范圍。盡管GC-MS/MS法的靈敏度較好,但儀器價格相對較高,限制了其推廣應用。免疫分析法、生物測定法、電化學傳感器法、高效毛細管電泳法等一些新興的檢測方法,體現了較好的開發前景,但還需要進一步優化。
結合目前煙草中擬除蟲菊酯類農藥殘留量檢測的現狀,提出今后研究的方向:一是開發新的擬除蟲菊酯類農藥的檢測方法。為適應煙草病蟲害防治情況的變化,一些新型的擬除蟲菊酯類農藥也不斷開發出來,因此對于新型農藥檢測方法的研究仍需要持續進行;二是目前廣泛采用的GC-ECD法中,仍然存在樣品分析時間長、干擾因素多等問題,持續不斷地對樣品前處理技術進行優化,尚有很大的挖掘空間;三是針對LC-MS/MS法中擬除蟲菊酯類農藥靈敏度低的問題,進一步提高儀器性能并優化分析參數,從而實現包含擬除蟲菊酯在內的煙草中多種農藥的同時分析;四是加大對免疫分析、傳感器技術、芯片技術以及分子印跡技術等一批新型技術的開發力度,實現煙草中痕量農藥的高通量快速檢測。