利奈唑胺葡萄糖注射液的質(zhì)量分析

裘亞 張含智 丁穎 呂丹丹 趙敬丹 張夢(mèng)悅 劉浩

(上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，上海 201203)

利奈唑胺(linezolid)是由美國(guó)Pharmacia & Upjohn公司(已被Pfizer公司收購(gòu))研制開(kāi)發(fā)的首個(gè)惡唑烷酮類(lèi)抗菌藥物(圖1)，主要用于治療革蘭陽(yáng)性菌及多重耐藥菌引起的感染；2000年在美國(guó)上市[1]，2006年在中國(guó)獲批上市。目前國(guó)內(nèi)上市的劑型包括利奈唑胺片、利奈唑胺干混懸劑和利奈唑胺葡萄糖注射液。國(guó)產(chǎn)利奈唑胺葡萄糖注射液于2015年獲批上市。2020年利奈唑胺葡萄糖注射液被列為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種。

根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品數(shù)據(jù)信息，利奈唑胺葡萄糖注射液共有9家生產(chǎn)企業(yè)(8家國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)和1家國(guó)外生產(chǎn)企業(yè))，17個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，2種規(guī)格，分別為100 mL(0.2 g利奈唑胺)和300 mL(0.6 g利奈唑胺)。本次抽驗(yàn)共完成83批樣品的檢驗(yàn)，規(guī)格包括100 mL(57批)和300 mL(26批)；涉及5家制劑生產(chǎn)企業(yè)，7個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)；從生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)營(yíng)企業(yè)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)抽取的樣品占比分別為13.3%、66.3%和20.5%。經(jīng)調(diào)研，各制劑生產(chǎn)企業(yè)所用利奈唑胺原料藥合成工藝均存在差異；藥用輔料包括葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和注射用水，其中不同企業(yè)的產(chǎn)品處方中檸檬酸和檸檬酸鈉的用量稍有差異。

中國(guó)藥典2015年版、歐洲藥典10.0版、英國(guó)藥典2020年版、美國(guó)藥典43版及日本藥典17版均未收載利奈唑胺葡萄糖注射液；僅美國(guó)藥典43版收載利奈唑胺。利奈唑胺葡萄糖注射液的現(xiàn)行法定執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)。本研究依據(jù)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合探索性研究情況，對(duì)當(dāng)前利奈唑胺葡萄糖注射液的質(zhì)量狀況進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)與分析，并對(duì)現(xiàn)行法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提出改進(jìn)建議。

1 儀器與試藥

Waters 2695e型高效液相色譜儀；Agilent 1260型高效液相色譜儀；Agilent 1100-6550型高效液相-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent1200-AB Sciex 5000型Q-Trap液相質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent 8800型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。

83批次利奈唑胺葡萄糖注射液均為2020年度國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，涉及5 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)(A、B、C、D和E企業(yè))；利奈唑胺(USP，批號(hào)：R072F0，99.6%)；葡萄糖(EP，批號(hào)：1.0，91.0%)；3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺(阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：C1907130，98.0%)；BHA(批號(hào)：81202899，98%)、BHT(批號(hào)：MCCC0032，99.0%)、TBHQ(批號(hào)：S2E7J-OM，98.0%)、抗氧劑1010(批號(hào)：MKCK3424，98%)、抗氧劑330(批號(hào)：MKBW7797V，99.0%)、抗氧劑1076(批號(hào)：MKCK8428，99%)均來(lái)自于阿法埃莎化學(xué)有限公司；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬與電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)195044-2)；鈀標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬與電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)189029)；混合內(nèi)標(biāo)溶液(Agilent，批號(hào)1-152YJY2)；乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸均為色譜純，正己烷、無(wú)水乙醇、異丙醇、二乙胺和三乙胺均為分析純，水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 法定檢驗(yàn)方法

83批樣品的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20180010、國(guó)家局標(biāo)準(zhǔn)YBH01092015、YBH01882016、YBH03822018和YBH00132019。主要檢驗(yàn)項(xiàng)目包括鑒別、對(duì)映異構(gòu)體、有關(guān)物質(zhì)、葡萄糖和含量測(cè)定等。

2.2 探索性研究方法

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)

色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液；線(xiàn)性梯度洗脫(0～2 min，B為10%；2～20 min，B為10%→20%；20～35 min，B為20%→75%；35～45 min，B為75%；45～50 min，B為75%→10%；5 0 ～5 5 m i n，B 為1 0%)；流速：1.0 m L/m i n；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；樣品濃度：1.0 mg/mL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，正離子模式采集，掃描范圍(m/z)：50～1200，毛細(xì)管電壓：3500 V，錐孔電壓：1000 V，去溶劑溫度：200℃，干燥氣流量：14 L/min，碰撞電壓分別為10、20和30 eV。

2.2.2 對(duì)映異構(gòu)體檢查

色譜柱：KR CHI-DMB(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：正己烷-無(wú)水乙醇-三乙胺(600:400:2)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；樣品濃度：0.4 mg/mL。

2.2.3 葡萄糖含量測(cè)定

色譜柱：YMC-Pack PolyamineⅡ(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈-水(75:25)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；示差折光檢測(cè)器；進(jìn)樣量：100μL；樣品濃度：2.5 mg/mL。

2.2.4 潛在基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)

色譜柱：Agilent poroshell EC-C18(2.7 μm，4.6 mm×50 mm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B：乙腈，線(xiàn)性梯度洗脫(0～5min，B為10%→30%；5～5.1 min，B為30%→90%；5.1～8 min，B為90%；8～8.1 min，B為90%→10%；8.1～12 min， B為10%)；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：采用電噴霧離子源，正離子模式采集；離子源溫度：500℃；電噴霧電壓：5500 V；CUR：20 L/min；CAD：Medium L/min；GS1：35 L/min；GS2：35 L/min；定量離子對(duì)：197.2-131.1；定性離子對(duì)：197.2-111.1。

對(duì)照品溶液的配制：稱(chēng)取適量的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺對(duì)照品用10%乙腈溶液溶解稀釋并制成2500 ng/mL的溶液，作為線(xiàn)性?xún)?chǔ)備溶液，精密量取適量，用10%乙腈溶液稀釋分別制成1、5、25、50、100和250 ng/mL的溶液，作為S1～S6線(xiàn)性對(duì)照品溶液。

供試品溶液的配制：精密量取利奈唑胺葡萄糖注射液1 mL，加10%乙腈溶液1.0 mL，混勻。

2.2.5 包材相容性研究

抗氧劑：色譜柱：YMC ODS-AM(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：乙腈；線(xiàn)性梯度洗脫(0～7 min，B為35%；7～14 min，B為35%→98%；14～42 min，B為98%；42～43 min，B為98%→35%；45～50 min，B為35%)；流速：1.9 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；對(duì)照品溶液進(jìn)樣量：10 μL；供試品溶液進(jìn)樣量：100 μL。

金屬元素：氦碰撞單四級(jí)桿模式；功率1550 W；采樣深度10.0 mm；載氣流量0.50 L/min；霧化器泵速0.10 r/s；S/C溫度2℃；重復(fù)讀數(shù)次數(shù)3次；分析模式全定量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗(yàn)結(jié)果

按法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，83批利奈唑胺葡萄糖注射液的合格率為100%；但因各法定標(biāo)準(zhǔn)主要檢驗(yàn)項(xiàng)目的方法及控制限度均存在差異，故難以根據(jù)法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)不同企業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較。

3.2 探索性研究結(jié)果

3.2.1 有關(guān)物質(zhì)

本次國(guó)抽樣品涉及的法定標(biāo)準(zhǔn)中JX20180010、YBH01092015、YBH01882016和YBH03822018標(biāo)準(zhǔn)采用了以0.1%三氟乙酸溶液-0.1%三氟乙酸乙腈溶液為流動(dòng)相體系的梯度洗脫HPLC 系統(tǒng)，YBH00132019標(biāo)準(zhǔn)采用了以0.1%三乙胺溶液-甲醇為流動(dòng)相體系的梯度洗脫HPLC系統(tǒng)；且各標(biāo)準(zhǔn)中所控制的特定雜質(zhì)的名稱(chēng)、數(shù)量和限度均各不相同(各標(biāo)準(zhǔn)共計(jì)含15個(gè)特定雜質(zhì))。美國(guó)藥典43版中利奈唑胺有關(guān)物質(zhì)檢查采用以磷酸二氫鉀溶液-甲醇-乙腈為流動(dòng)相體系的梯度洗脫HPLC 系統(tǒng)，并對(duì)3個(gè)特定雜質(zhì)的限度進(jìn)行了規(guī)定。在本部分探索性研究中，在對(duì)上述有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行比較分析的基礎(chǔ)上，優(yōu)化建立了能對(duì)利奈唑胺葡萄糖注射液中15個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行有效分離的HPLC系統(tǒng)[2]，見(jiàn)“2.2.1”，系統(tǒng)適用性圖譜和各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分別如圖2和表1所示。采用新建的有關(guān)物質(zhì)方法對(duì)83批抽驗(yàn)樣品進(jìn)行分析，各企業(yè)樣品測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表1 各雜質(zhì)分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)和來(lái)源Tab.1 Proposed molecular formulas, structures and sources of impurities 1～15

表2 各企業(yè)產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Tab.2 The related substance results of the samples from different manufacturers

由測(cè)定結(jié)果可以看到，不同企業(yè)產(chǎn)品中各雜質(zhì)水平基本相當(dāng)，雜質(zhì)總量均在1.0%左右，且除部分樣品中有少量工藝雜質(zhì)(雜質(zhì)5)檢出外，檢出的其余6個(gè)已知雜質(zhì)均為降解雜質(zhì)；提示雖然目前各制劑企業(yè)所用利奈唑胺原料藥的合成工藝存在著差異，但經(jīng)純化工藝后均能有效地將工藝雜質(zhì)去除。C企業(yè)和D企業(yè)產(chǎn)品中有1個(gè)含量大于0.10%且保留時(shí)間相同的未知雜質(zhì)檢出，采用LC-Q-TOF對(duì)該雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析[2]。

3.2.2 對(duì)映異構(gòu)體

利奈唑胺分子結(jié)構(gòu)中含1個(gè)手性中心，其存在一個(gè)對(duì)映異構(gòu)體[3]。5個(gè)法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均采用手性固定相的HPLC法控制樣品中的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，但方法和限度均存在差異。其中，YBH01092015標(biāo)準(zhǔn)采用CHIRALPAK AD-H色譜柱進(jìn)行測(cè)定，YBH03822018標(biāo)準(zhǔn)采用CHIRALPAK AY-H色譜柱進(jìn)行測(cè)定，這兩種色譜柱均不宜分析含水供試品；試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，多次進(jìn)樣分析后，出現(xiàn)了柱效顯著下降的現(xiàn)象。因此，我們選擇YBH01882016、YBH00132019和JX20180010標(biāo)準(zhǔn)所采用的Kromasil DMB色譜柱，建立了統(tǒng)一的HPLC測(cè)定方法，見(jiàn)“2.2.2”，規(guī)定利奈唑胺峰與對(duì)映異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)不小于2.0。

按新建立的方法對(duì)83批抽驗(yàn)樣品進(jìn)行分析，A和D企業(yè)樣品中均未檢出對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，B、C和E企業(yè)樣品中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量均小于0.04%，說(shuō)明目前各企業(yè)制劑所使用的利奈唑胺原料藥的生產(chǎn)工藝均能有效控制對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量。

3.2.3 葡萄糖含量測(cè)定

YBH00132019標(biāo)準(zhǔn)采用旋光度測(cè)定法測(cè)定樣品中的葡萄糖含量，專(zhuān)屬性較差；YBH01882016和YBH03822018標(biāo)準(zhǔn)采用容量滴定法(間接碘量法)，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)人員要求較高，且實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣；YBH01092015和JX20180010標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法。我們參照YBH01092015和JX20180010標(biāo)準(zhǔn)，建立了統(tǒng)一的HPLC方法，見(jiàn)“2.2.3”。

按擬定的方法對(duì)83批抽驗(yàn)樣品進(jìn)行測(cè)定，葡萄糖含量均在98.3%～103.5%之間(以標(biāo)示量計(jì))，平均值為101.0%；各企業(yè)產(chǎn)品的葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果比較圖見(jiàn)圖3，A企業(yè)產(chǎn)品的葡萄糖含量相對(duì)較低。

3.2.4 潛在基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)

函調(diào)中反饋的資料顯示：3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺為B企業(yè)利奈唑胺原料藥合成工藝中的中間產(chǎn)物；而C企業(yè)和D企業(yè)利奈唑胺原料藥生產(chǎn)工藝的起始原料均包括了N-芐氧羰基-3-氟-4-嗎啉基苯胺，如在后續(xù)反應(yīng)中不能除盡該化合物，則其可能降解生成3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺。3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺為芳香胺類(lèi)化合物，屬潛在基因毒性雜質(zhì)；B企業(yè)和E企業(yè)原料藥內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中均對(duì)其進(jìn)行了控制(限度分別為0.6和16 ppm)；但在注射液中均未對(duì)其進(jìn)行控制。采用LC-MS方法(見(jiàn)“2.2.4”)對(duì)各企業(yè)代表性樣品中的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺進(jìn)行了檢測(cè)；結(jié)果如表3所示，各企業(yè)產(chǎn)品中均有潛在基因毒性雜質(zhì)3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺檢出。另外，各企業(yè)樣品在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)(溫度40℃，相對(duì)濕度75%)條件下放置3個(gè)月后，3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺的含量均略有增加，提示利奈唑胺在溶液狀態(tài)中可能降解生成微量的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺。各制劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注利奈唑胺葡萄糖注射液中的3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺的含量變化，必要時(shí)在利奈唑胺葡萄糖注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增訂3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺檢查項(xiàng)，以進(jìn)一步保證臨床用藥的安全性。

3.2.5 包材相容性研究

藥品與藥品包裝材料之間的相容性研究已成為目前藥品質(zhì)量研究中的重要組成部分[4]。本次國(guó)抽樣品有玻璃瓶裝和多層共擠輸液袋裝兩種包裝形式，見(jiàn)表3。多層共擠輸液袋又稱(chēng)軟袋，是繼玻璃輸液瓶、塑料輸液瓶之后出現(xiàn)的更為優(yōu)良的輸液產(chǎn)品包裝，具有不含黏合劑、增塑劑，熱封性好、可高溫滅菌、無(wú)需排氣針、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)小和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)[5-6]；但為了在存儲(chǔ)和使用過(guò)程中更加穩(wěn)定，多層共擠輸液袋在加工過(guò)程中通常需加入抗氧劑、潤(rùn)滑劑和抑酸劑等助劑，其中常用的抗氧劑主要為酚類(lèi)抗氧劑，如抗氧劑1010、1076和330等[7]。建立了能同時(shí)檢測(cè)6種常見(jiàn)酚類(lèi)抗氧劑(BHT、 BHA、TBHQ、330、1010和1076)的HPLC方法(見(jiàn)“2.2.5”)，其檢測(cè)限分別為0.2、0.2、0.5、1、1和1 μg/mL；對(duì)各企業(yè)的代表性樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出上述抗氧劑。

表3 3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺測(cè)定結(jié)果Tab.3 The measurement results of 3-fluoro-4-morpholin-4-yl-phenylamine

多層共擠輸液袋裝加工過(guò)程中潤(rùn)滑劑和抑酸劑等助劑的添加，可能會(huì)引入少量的有害金屬元素，其在與藥液長(zhǎng)時(shí)間接觸后可能會(huì)遷移至注射液中[8]。另外，玻璃瓶包裝的注射液中也可能發(fā)生有害金屬元素從玻璃瓶遷移至藥液的情況[9]。因此，在本部分探索性研究中，我們還采用ICP-MS對(duì)各企業(yè)代表性樣品中的鉻、銅、鋅、鈀、鎘、錫、鋇和鉛等元素殘留進(jìn)行了檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果顯示，按每日攝入最大用量計(jì)算，各元素含量均遠(yuǎn)小于其PDE值。

4 結(jié)論

本次評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)采用法定檢驗(yàn)結(jié)合探索性研究對(duì)利奈唑胺葡萄糖注射液的質(zhì)量和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)。通過(guò)探索性研究，利用建立的能同時(shí)對(duì)15個(gè)已知雜質(zhì)進(jìn)行有效分離的高效液相色譜方法，結(jié)合LC-Q-TOF技術(shù)對(duì)樣品中含量大于0.10%的未知雜質(zhì)的初步結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)各企業(yè)樣品的雜質(zhì)譜基本一致；提示雖然目前各制劑企業(yè)所用利奈唑胺原料藥的合成工藝存在著差異，但經(jīng)純化工藝后均能有效地將工藝雜質(zhì)去除。采用LC-MS對(duì)樣品中的潛在基因毒性雜質(zhì)3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各企業(yè)產(chǎn)品中均有該雜質(zhì)檢出，且在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中，3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺的含量略有增加，提示各制劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)予以關(guān)注，必要時(shí)應(yīng)在利奈唑胺葡萄糖注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增訂3-氟-4-(4-嗎啉基)苯胺檢查項(xiàng)。

按照現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，本次抽驗(yàn)樣品均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均為局頒標(biāo)準(zhǔn)，各標(biāo)準(zhǔn)在檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置、檢驗(yàn)方法和限度等方面的規(guī)定不盡相同，因此較難通過(guò)法定檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)之間的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行比較。提示利奈唑胺葡萄糖注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待統(tǒng)一與提高。