雞Tgfβ1干擾表達載體的構建及在MDCC-MSB1細胞中的干擾表達

門凱凱， 劉佳隆， 郭亞格， 張 瑾， 余祖華

(河南科技大學 動物疫病與公共衛生重點實驗室，河南 洛陽 471023)

0 引言

近年來，雞腫瘤性疾病的發病率越來越高，雞腫瘤性疾病的多變性、高發性已經給養禽業造成巨大的威脅[1-2]。雞馬立克病(Marek’s disease, MD)是由隸屬于強致病性α皰疹病毒的馬立克病毒(Marek’s disease virus, MDV)感染雞后引起的，可在雞體內迅速誘發惡性T細胞淋巴瘤，給養禽業帶來了巨大損失，因此，研究其發病機制是必要的。轉化生長因子β(transforming growth factor-β,Tgfβ)是一種多功能細胞因子，通過細胞表面受體信號轉導參與許多疾病的病理生理過程，其表達量變化與腫瘤疾病有著密切聯系[3-5]。Tgfβ1作為Tgfβ的一個亞型，在調節免疫細胞分化、維持免疫細胞功能和免疫穩態中起著重要作用，是腫瘤細胞中最常見的上調因子[6-9]，在腫瘤發生發展中發揮重要的致癌或抑癌功能[10]，且Tgfβ1信號通路分子對腫瘤的調控作用是目前學術界研究熱點之一，但關于雞Tgfβ1在雞MD腫瘤發生發展中的作用及其機制有待深入研究。據此，本研究構建了雞Tgfβ1的干擾表達載體，將其轉染MDV轉化的腫瘤細胞系MDCC-MSB1并鑒定抑制表達效果，為后續研究雞Tgfβ1在MD腫瘤發生發展中的作用及調控機制提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

MDV轉化的腫瘤細胞系MDCC-MSB1、pG1.2載體、DH5α感受態均由河南科技大學動物疫病與公共衛生實驗室保存；質粒提取試劑盒購于北京天根生化有限公司；限制性內切酶BsaI(RO535V)、SacI(ER1135)分別購于NEB和Thermo Scientific公司；反轉錄試劑盒(RR047A)、SYBR Green Master Mix(RR420)購于Taraka公司；Lipofectamine2000試劑、Opti-MEM培養基購于美國Invitrogen公司；Trizol試劑購于GenStar公司；RIPI裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒購于Servicebio公司；兔抗雞TGFβ1抗體(aa260-373)購自美國LifeSpan公司，HRP-羊抗兔二抗(ab6721)、小鼠抗β-actin(ab8226)購自美國Abcam公司；HRP-羊抗鼠二抗(SA00001-1)購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 雞Tgfβ1基因靶向短發夾核糖核酸序列的設計與合成

根據GenBank檢索的雞Tgfβ1基因全序列(NM-001318456.1)以及短發夾核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid, shRNA)的設計原則，確定目標基因，設計出3條shRNA寡核苷酸序列。確定目標基因序列分別為Gallus-Tgfβ1-1：GCATCTTCTTCGTGTTCAA(位于Tgfβ1mRNA 110～168)；Gallus-Tgfβ1-2：GCATCTCCATCGAAGGCTT(位于Tgfβ1mRNA 109～167)；Gallus-Tgfβ1-3：CCACGAACCCAAAGGTTAT(位于Tgfβ1mRNA 106～163)。再按序列結構:BsaI+Sense+Loop+Antisense+終止信號+SacI+BsaI設計雞Tgfβ1的shRNA鏈(見表1)，送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Tgfβ1 shRNA基因片段序列及靶點

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物的設計與合成

根據GenBank檢索的Tgfβ1mRNA基因全序列(NM-001318456.1)和雞GAPDH全序列(NC-052532.1),分別設計雞Tgfβ1和雞GAPDH熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)引物序列(見表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 熒光定量PCR引物

1.2.3Tgfβ1干擾表達載體的構建與鑒定

每個單鏈基因片段用30 μL annealing buffer溶解，得到上游2 μL +下游2 μL + 16 μL annealing buffer，94 ℃退火，室溫冷卻，100倍稀釋退火產物。BsaI酶切pG-1.2質粒，酶切體系：pG1.2質粒2 μg，BsaI 2 μL，CutSmart 4 μL，補ddH2O至40 μL，37 ℃酶切過夜。回收1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳大片段與退火片段連接。稀釋的退火片段1 μL，質粒載體線性化大片段1 μL，5×Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，ddH2O補至10 μL，22 ℃反應過夜。各取10 μL連接產物轉化至感受態細胞DH5α，分別涂布于含卡那霉素抗性(50 μg/mL) LB平板上，37 ℃恒溫培養過夜。從耐卡那霉素(50 μg/mL) LB平板中挑選單克隆菌落，接種于5 mL耐卡那霉素LB培養基中，37 ℃恒溫(180 r/min)過夜。試劑盒提取質粒，經SacI酶切鑒定正確的質粒送測序。

1.2.4 MDCC-MSB1培養與Tgfβ1干擾表達載體的轉染

MDCC-MSB1細胞在10%(體積分數)胎牛血清RIPM1640培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱培養。以每孔1×106個在對數生長期狀態好的MDCC-MSB1細胞接種于6孔板。轉染共分成3組，每組分別為重組質粒及相應的pG1.2空載，即pG1.2-Tgfβ1shRNA-1和干擾NC-1組、pG1.2-Tgfβ1shRNA-2和干擾NC-2組、pG1.2-Tgfβ1shRNA-3和干擾NC-3組，每組3個復孔。轉染前2 h，細胞培養液換成無血清1640培養基。質粒在100 μL opti-MEM培養基稀釋；以質粒∶Lipofectamine2 000轉染試劑=1 μg∶2 μL比例配制opti-MEM培養基-脂質體復合物100 μL，室溫靜置5 min。將兩液混合均勻靜置20 min后加入6孔板MDCC-MSB1細胞內輕輕混勻。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測Tgfβ1mRNA表達

Trizol法提取轉染48 h各組細胞總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)，用cDNA做SYBR Green Master Mix qRT-PCR的體系：TB GreenPremix DimerEraser 10 μL、PCR Forward Primer 0.4 μL、PCR Reverse Primer 0.4 μL、Template 2 μL、ddH2O補至20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循環。GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算各組Tgfβ1mRNA相對表達量，根據相對表達量篩選出抑制率最高的干擾表達載體。

1.2.6 Western blot法檢測TGFβ1蛋白表達

用抑制率最高的干擾表達載體pG1.2-Tgfβ1shRNA-1轉染MDCC-MSB1細胞，Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定提取的48 h各組細胞蛋白濃度，加樣量為每樣50 μg，加5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min。經5%(質量分數)濃縮膠和10%(質量分數)分離膠SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至0.22 μm 聚偏氟乙烯膜，用含4%(質量分數)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的TBST液4 ℃封閉2 h，用4% BSA的TBST液稀釋兔抗雞TGFβ1(1∶500)或小鼠單抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，第2天加入相應的HRP標記二抗4 ℃孵育3 h，超敏增強化學發光(enhanced chemiluminescence, ECL)法顯色。

1.2.7 統計學方法

SPSS20.0統計學軟件單因素方差分析或t-test分析數據，P<0.05為差異顯著，用*表示；P<0.01為差異極顯著，用**表示。

2 結果

2.1 雞Tgfβ1 干擾表達載體的酶切和測序鑒定

M.marker；1，2.PG1.2-Tgfβ1 shRNA-1；3，4.PG1.2-Tgfβ1 shRNA-2；5，6.PG1.2-Tgfβ1 shRNA-3。 圖1 PG1.2-Tgfβ1 shRNA酶切鑒定

pG1.2載體帶有一個SacⅠ酶切位點，再根據pG1.2載體序列，引入SacⅠ位點設計雞Tgfβ1的干擾表達片段。提取陽性質粒被SacⅠ酶切出一條約600 bp條帶，即表明退火片段連接到pG1.2載體。PG1.2-Tgfβ1shRNA酶切鑒定見圖1。由圖1可知：SacⅠ酶切陽性重組質粒后，電泳結果顯示各質粒均有一條大小約600 bp的條帶。測序結果比對顯示，測序結果與原設定序列完全一致，結果表明設計合成的各shRNA片段均成功插入pG1.2載體，成功構建了雞Tgfβ1的干擾表達質粒，分別為PG1.2-Tgfβ1shRNA-1、PG1.2-Tgfβ1shRNA-2和PG1.2-Tgfβ1shRNA-3。

2.2 靶向雞Tgfβ1的干擾片段篩選

按照轉染試劑Lipofectamine2000和Tgfβ1干擾載體2 μL∶1 μg的比例,將構建的PG1.2-Tgfβ1shRNA-1、PG1.2-Tgfβ1shRNA-2、PG1.2-Tgfβ1shRNA-3質粒和各自空載PG1.2載體分別轉染MDCC-MSB1細胞，48 h后提取各組細胞總RNA，qRT-PCR檢測Tgfβ1相對表達量，分析比較其抑制效果。Tgfβ1干擾載體mRNA水平抑制效果見圖2。由圖2可知：構建的針對雞Tgfβ1mRNA不同靶位點的3個干擾載體均有顯著的抑制效果，其抑制率分別為74.43%、66.97%和73.44%。

圖2 Tgfβ1 干擾載體mRNA水平抑制效果

2.3 干擾表達載體對MDCC-MSB1細胞內雞TGFβ1蛋白表達的干擾效果

用抑制率最高的干擾載體PG1.2-Tgfβ1shRNA-1轉染MDCC-MSB1細胞，轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察PG1.2-Tgfβ1shRNA-1組和PG1.2干擾NC組MDCC-MSB1均有熒光(見圖3a和圖3b)，空白對照組無熒光(見圖3c)。48 h提取細胞總蛋白，Western blot檢測TGFβ1蛋白表達量(見圖4a)并進行蛋白條帶的灰度值分析(見圖4b)。圖4b中，縱坐標為目的蛋白TGFβ1灰度值與內參β-actin灰度值的比值。與空白組相比，PG1.2-Tgfβ1shRNA-1組細胞內TGFβ1蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，PG1.2干擾NC組細胞內TGFβ1蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)。

(a) PG1.2-Tgfβ1 shRNA轉染的MSB1細胞 (b) PG1.2干擾NC轉染的MSB1細胞 (c) 陰性對照(無轉染的MSB1細胞)

(a) TGFβ1蛋白、β-actin內參蛋白Western blot

3 討論

近年來,隨著對腫瘤發病機制的不斷深入了解和研究，人們越來越清楚地認識到腫瘤疾病的發生涉及各方面的因素，并且在發展中牽涉更多步驟的病理過程[11-12]。腫瘤疾病的發病機制之所以是復雜的，是因為其在發生發展過程中涉及Tgfβ1/Smad等多條信號傳導通路及多種細胞因子，這些信號通路和細胞因子共同構成復雜的調控網絡[13-14]。Tgfβ1作為眾多信號分子中的一員，調節著多細胞生物生理發育的各個方面，由于其在動物界的高度保守性，使其在眾多信號分子中脫穎而出，與其相關的信號通路被深入研究。Tgfβ1信號通路在許多類型的腫瘤中發揮作用，其通路發揮作用的機制被越來越多的學者研究，并取得了一定的研究成果，文獻[15]提出miR-130a-3p靶向GCNT4并激活Tgfβ1/Smad3信號通路，可促進胃癌細胞生長。文獻[16]證明參皂苷Rg2通過調節Tgfβ1/Smad信號通路減輕心肌纖維化，從而改善心功能損害。Tgfβ1信號通路在腫瘤的發生發展中起到重要作用，Tgfβ1主要是通過跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體TgfβR1參與腫瘤調控，在腫瘤的發生過程中Tgfβ1主要通過組織微環境Smad和非Smad通路促進或抑制腫瘤發生[17]。在腫瘤的發生、發展過程中，Tgfβ1表現出不同的作用，Tgfβ1信號通路在腫瘤早期抑制腫瘤細胞的增殖，并將細胞阻止于G1期[18-19]。隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞逃避發生突變的Tgfβ1信號通路介導的生長抑制效應，腫瘤細胞大量增殖[20]。Tgfβ1既是一種抑制因子又是一種啟動子，這種雙重作用的機制尚不清楚，但在Tgfβ1/Smad信號通路中任何一部分的中斷或缺失，都會導致該通路的抑瘤作用減弱，進而促進了腫瘤的發展。文獻[21]闡明調控Tgfβ1/Smad4通路可對宮頸癌SiHa細胞自噬關鍵基因Lc3產生影響，從而調控宮頸癌SiHa細胞的生物學特性。Tgfβ1/Smad信號通路的改變對其下游基因表達的影響，是其調控各種疾病更為關鍵的步驟，這種通路機制成為學術界研究的熱點，研究Tgfβ1及其信號通路在腫瘤發生中的作用及機制對腫瘤的有效防控具有十分重要的意義[22]。Tgfβ1信號通路在其他腫瘤疾病被深入研究，但在雞腫瘤疾病的作用及機制還有待深入研究，本研究基于Tgfβ1在腫瘤細胞的這種重要作用，通過構建雞Tgfβ1干擾表達載體，初步探索構建的干擾表達重組質粒對MDCC-MSB1細胞中Tgfβ1表達量的影響，為進一步研究Tgfβ1在MD腫瘤發生中的作用及機制奠定基礎。

RNA干擾技術介導細胞內特異靶基因表達沉默，使相應的功能表型出現缺失現象[23]，文獻[24]在胰腺癌中觀察到通過微小核糖核酸對ANLN基因的下調，抑制了細胞的侵襲性。以Tgfβ1為靶目標，RNA干擾技術為研究Tgfβ1功能及其在腫瘤性疾病中的調控機制提供了新維度。本研究根據雞Tgfβ1基因序列和shRNA設計原則設計了3個shRNA序列，通過基因重組技術將shRNA克隆入載體，構建pG1.2-Tgfβ1shRNA重組表達質粒。酶切和測序證實3種重組質粒插入序列與設計靶基因片段一致。用構建成功的3種重組質粒轉染MDCC-MSB1細胞，48 h后提取各組細胞總RNA，進行qRT-qPCR檢測Tgfβ1的表達量變化，結果顯示構建的3種干擾表達質粒轉染細胞后，對細胞內Tgfβ1 mRNA的表達量均有不同程度的抑制，其抑制率最高可達70%以上。篩選抑制效率最高的干擾表達重組質粒pG1.2-Tgfβ1shRNA-1轉染MDCC-MSB1細胞，于轉染后48 h提取細胞總蛋白，Western blot法檢測結果顯示轉染干擾表達重組質粒pG1.2-Tgfβ1shRNA-1后,TGFβ1蛋白表達量顯著降低。因此，本研究成功構建了pG1.2-Tgfβ1shRNA干擾表達載體，且其可以干擾MDCC-MSB1細胞中Tgfβ1的表達，為后續進一步探索Tgfβ1及其調控的關鍵分子在MD腫瘤發生中的作用奠定基礎。