合成綠原酸內生細菌的篩選、鑒定及發酵培養基的初步優化

邱萌霞，果秀梅，薛 冰，張澤洋，賈士儒，崔建東

(1. 食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 山東大樹達孚特膳食品有限公司，菏澤 274000)

綠原酸(chlorogenic acid，CGA)又稱咖啡酰奎寧酸，是金銀花、杜仲、咖啡、茵陳等許多中草藥的主要活性成分之一，是廣泛存在于各種植物中的苯丙素類化合物[1]．研究[2]發現綠原酸具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及預防糖尿病、高血脂、肝炎等多種生物活性，在食品、醫藥、日用化工等領域被廣泛應用[3-5]，且近年綠原酸已被國家食品藥品監督管理局批準為抗癌藥物[6-7]．

目前綠原酸的主要生產方法主要是通過超聲波法、水提取法等方法從植物的根、葉、花、果實中直接進行提取，如馬鈴薯皮[8-9]、微藻、紫甘薯[10]、草本植物等[11]．由于中藥植物生長周期長、資源匱乏，綠原酸含量低以及提取工藝復雜、成本高等問題，導致綠原酸生產效率較低．

植物內生菌是生活在健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙，對植物無害的一些真菌或細菌[12].目前從藻類、苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中均已分離到內生菌，具有豐富的生物多樣性[13]．研究[14]表明，內生菌可以產生與宿主相同或相似的活性成分，是宿主植物活性物質的良好替代生產資源．劉洋露等[15]從金銀花中分離得到了合成綠原酸的內生細菌B3．冷慕嬋等[16]以金銀花的不同部位為原材料，采用組織塊法從金銀花中篩選分離出80株具有合成綠原酸能力的內生真菌．以上結果表明，某些中藥植物內生菌具有合成綠原酸的能力．

因此，本研究從金銀花葉、紅薯葉、薄荷葉、蒲公英葉和杜仲葉中分離篩選出具有合成綠原酸的內生菌，進而通過微生物發酵技術高效生產綠原酸．這樣，不僅可以減少對中藥植物的依賴，而且會降低綠原酸的生產成本，并將為開發產綠原酸工程菌株以及微生物發酵生產綠原酸奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料合成綠原酸內生菌的植物來源：金銀花葉、紅薯葉、薄荷葉、蒲公英葉和杜仲葉，市售．

1.1.2 試劑與儀器氫氧化鈉，分析純，博歐特(天津)化工貿易有限公司；無水乙醇和乙酸乙酯，分析純，天津市津東天正精細化學試劑廠；甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；氯化鈉和氯化鋁，分析純，天津市四通化工廠；瓊脂粉和牛肉膏，生物試劑，北京奧博星生物技術有限公司；胰蛋白胨，生物試劑，賽默飛世爾科技公司；綠原酸(標準品)，北京索萊寶科技有限公司．

LRH–250–SHE型恒溫恒濕培養箱，韶關市泰宏醫療器械有限公司；ZHJH–C1115B型生物潔凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX–75L–I型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；VOS–90A型真空干燥箱，上海恰森儀器有限公司；GZX–9070型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DTC–15J型超聲波清洗機，上海比浪儀器制造有限公司；ZQZY–CS8型振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司．

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標準溶液的配制

以50%甲醇為溶劑，分別配制質量濃度為5、25、50、75、100μg/mL綠原酸標準溶液．

1.2.2 培養基的配制

牛肉膏蛋白胨篩選培養基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，AlCl30.75mmol/L，pH 7.2～7.4，121℃高溫滅菌．

初始發酵培養基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，121℃高溫滅菌．

單因素優化基礎培養基：磷酸二氫鉀 1g/L，磷酸氫二鉀 1g/L，NaCl 1g/L，121℃高溫滅菌．

1.2.3 合成綠原酸內生菌的分離與純化

參考Weber等[17]的方法，將新鮮的金銀花葉、紅薯葉、薄荷葉、蒲公英葉和杜仲葉用無菌水清洗3次，置于超凈工作臺后紫外滅菌30min，將葉片樣品用無菌水清洗后放入75%的酒精中浸泡60s，取出葉片樣品用無菌水清洗2次后放入0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡15s，再次用無菌水沖洗葉片樣品．將葉片樣品置于超凈工作臺后吹干，用無菌剪切成1cm的小段．將5種葉片樣品切口向下分別置于牛肉膏蛋白胨篩選培養基平板上，以最后一次無菌水沖洗液和完整滅菌葉片為對照，置于37℃的培養箱中培養48h．將長出的紅色菌落劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基上，置于37℃的培養箱中培養48h，分離得到單菌落．

1.2.4 菌種液體發酵培養

將分離出的單菌落接種到液體發酵培養基中，置于37℃、200r/min的恒溫搖床中培養48h，對液體發酵培養基進行初步優化．

碳源優化：分別選擇蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和乳糖作為唯一碳源，設置5個質量濃度梯度10、20、30、40、50g/L．以不添加碳源為對照組，對篩選出來的菌株進行液體發酵培養(37℃、200r/min培養48h)，發酵結束后測定各發酵液中綠原酸含量．

氮源的優化：分別選擇蛋白胨、牛肉膏和玉米漿作為唯一有機氮源，硫酸銨、氯化銨和檸檬酸銨作為唯一無機氮源；設置5個質量濃度梯度3、4、5、6、7g/L，以不添加氮源作為對照組，對篩選出來的菌株進行液體發酵培養(37℃、200r/min培養48h)，發酵結束后測定各發酵液中綠原酸含量．

1.2.5 綠原酸的定性和定量測定

標準曲線的繪制：利用高效液相色譜(HPLC)對綠原酸的含量進行定量測定(出峰面積)．以不同質量濃度綠原酸標準品為橫坐標、峰面積為縱坐標．標準曲線的回歸方程為y＝26.795x＋36.897，R2＝0.9995．

發酵液中綠原酸的初步分離：3mL發酵液于10mL離心管中超聲破碎30min，12000r/min離心20min，取上清液并加入等體積的70%乙醇溶液，充分混勻后真空濃縮，再加入等體積的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層真空濃縮后，再加入等體積的50%甲醇溶液進行溶解，待用．

HPLC檢測條件：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相A為0.5%乙酸，流動相B為80%乙腈水溶液，流量1.0mL/min，柱溫35℃，326nm紫外檢測，進樣量為10μL．

1.2.6 菌株的形態鑒定

使用掃描電子顯微鏡和光學顯微鏡觀察菌體形態.

1.2.7 菌株的分子鑒定

臭氧作為一種強氧化劑，可以用來抑制或殺死多種病原菌，因此也可用于果蔬采后病害的防治。Sharpe等[24]研究了臭氧對灰霉菌的抑制作用，發現用6×10-7 mol/L的臭氧對灰霉菌處理48 h，氣生菌絲長度由4.6 mm下降到1 mm，孢子的形成能力受到抑制，死亡率達到90%以上，顯示出直接的殺菌能力。嚴德卿等[25]研究了臭氧對楊梅果實采后病害的影響，發現經過臭氧處理后好果率達到96.3%以上，明顯高于未經處理的好果率(76.6%)。

利用菌落PCR技術擴增內生菌的16S rDNA基因．PCR體系：菌液0.4μL，ddH2O 8μL，Taq酶10μL，上游引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)0.8μL，下游引物(5′-TACGGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)0.8μL．反應程序：95℃預變性3min；95℃變性15s，52℃退火40s，72℃延伸5min，循環30次．

對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(濃度為1.0%)驗證．0.2g瓊脂糖加入20mL電泳緩沖液(TAE溶液)中混勻后放入微波爐加熱融化，加入1μL溴化乙錠(5000×)染料充分混勻，將上述混合液倒入制膠板中凝固，獲得瓊脂糖凝膠．將瓊脂糖凝膠放入含有電泳液的電泳槽中，取5μL PCR產物和2μL上樣緩沖液混合均勻后加入凝膠孔中，接通電源開始電泳．

16S rDNA序列比對和系統發育分析：將PCR擴增產物送金唯智測序公司測序，并將測序結果在NCBI上GenBank數據庫中利用BLAST和KEGG搜索與菌株XJ-1的16SrDNA相關序列，利用MEGA7.0進行系統進化樹的構建．

2 結果與分析

2.1 產綠原酸菌株的分離與發酵產物的鑒定

按照Weber等[17]的方法，在pH 6.5～7.5的范圍內，Al3+可以與綠原酸上的羥基進行配位，形成相對穩定的CGA-Al3+絡合物，在培養基中顯示為紅色．按照此原理，從金銀花葉、薄荷葉、蒲公英葉、杜仲葉和紅薯葉中初步分離得到可能具有合成綠原酸能力的5株內生菌(分別記為XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5)．為了判斷菌株是否真正具有合成綠原酸的能力，使用HPLC的方法進一步測定了發酵液中的綠原酸含量，結果如圖1所示．

圖1 綠原酸的HPLC圖Fig. 1 HPLC chart of chlorogenic acid

由圖1可以看出：篩選出的各菌株發酵產物和綠原酸標準品具有相同的保留時間，均在3.613min左右，表明這5株菌均具有生產綠原酸的能力．同時，HPLC的定量檢測表明，內生菌株XJ-1、XJ-2、XJ-3、XJ-4和XJ-5發酵液中的綠原酸含量分別為9.9、3.2、6.6、5.8、4.9μg/mL．合成綠原酸能力最強的為菌株XJ-1，因此后續選擇菌株XJ-1為鑒定和優化培養的菌株．

2.2 菌株的形態及革蘭氏染色分析

菌株XJ-1的形態鑒定如圖2所示．菌株形狀為圓形，邊緣整齊，較黏稠，表面光滑，有隆起，顏色為白色，從菌落形態上初步判斷菌株XJ-1為細菌．革蘭氏染色表明菌株XJ-1為革蘭氏陽性細菌．掃描電子顯微鏡觀察菌株XJ-1為桿狀菌．

圖2 菌株XJ-1的形態鑒定Fig. 2 Morphological identification of strain XJ-1

2.3 菌株的分子鑒定

采用PCR技術對菌株XJ-1的16S rDNA基因進行體外擴增，并利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行驗證，結果如圖3所示．

圖3 瓊脂糖凝膠電泳Fig. 3 Agarose gel electrophoresis

圖3結果表明成功擴增出16SrDNA基因，該基因序列大小為1500bp左右，與細菌的16SrDNA基因大小基本一致[18]．對該基因在NCBI數據庫上進行序列同源性比對，發現它與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)相似度為97%，因此判斷該菌株為枯草芽孢桿菌．

利用MEGA7.0軟件構建了包含有芽孢桿菌等13個基因序列的系統進化樹(圖4)．從系統進化樹可以看出，菌株XJ-1與枯草芽孢桿菌位于同一集群組，表明菌株XJ-1屬于枯草芽孢桿菌．

圖4 菌株XJ-1的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain XJ-1

2.4 發酵培養基的初步優化

2.4.1 碳源

分別選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和果糖為唯一碳源，考察不同碳源對菌株XJ-1合成綠原酸的影響．結果顯示當碳源為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和乳糖時，發酵液中綠原酸的含量較低(小于1μg/mL)，表明該菌株不能很好地利用這4種碳源合成綠原酸．當以果糖為碳源時，發酵液中卻有綠原酸產生，因此以果糖為唯一碳源，研究不同濃度的果糖對綠原酸產量的影響，結果如圖5所示．隨著果糖濃度的增加，CGA的含量先增加后減少，在果糖質量濃度為30g/L時，CGA的含量達到最大值(7.39μg/mL)，說明高濃度的果糖可能會抑制菌株XJ-1合成綠原酸，因此選擇30g/L果糖作為碳源濃度．

圖5 不同果糖濃度對菌株XJ-1合成綠原酸的影響Fig. 5 Effects of different fructose concentrations on chlorogenic acid synthesis by strain XJ-1

2.4.2 氮源

考察了不同種類和濃度的氮源對菌株XJ-1合成綠原酸的影響，結果如圖6所示．

圖6 不同氮源對XJ-1合成綠原酸的影響Fig. 6 Effects of different nitrogen source on chlorogenic acid synthesis by strain XJ-1

不同種類和濃度的氮源對菌株XJ-1合成綠原酸的影響有明顯差距．菌株XJ-1合成綠原酸的產量隨著蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸銨、氯化銨和檸檬酸銨濃度的增加呈現出先增加后降低的趨勢．在所選擇的氮源中，利用檸檬酸銨為無機氮源時，菌株XJ-1表現出最高的合成綠原酸的能力；利用玉米漿為有機氮源時，菌株XJ-1合成綠原酸的能力最高．

2.4.3 發酵培養基主要成分的正交優化實驗

根據單因素實驗結果，選擇果糖、檸檬酸銨、玉米漿進行3因素3水平的正交實驗，結果見表1，方差分析見表2．

表1 正交實驗設計及其對綠原酸產量的影響Tab. 1 Orthogonal experimental design and its effect on chlorogenic acid yield

表2 方差分析Tab. 2 Variance analysis

從表1可以看出，各因素極差的大小反映了其對菌株XJ-1產綠原酸能力影響的主次，極差越大，影響越顯著[19]，故主次因素依次為檸檬酸銨＞果糖＞玉米漿．由表2可知：3個因素對產量的影響都不是特別顯著；此外，由表1可見以第5組的條件培養時綠原酸產量最高，即綠原酸的產量達到了24.02μg/mL，因此確定最優碳源為果糖30g/L，最優無機氮源為檸檬酸銨5g/L，最優有機氮源為玉米漿6g/L．Magdalena等[20]采用響應面(RSM)法優化水提法提取茶葉中的CGA，獲得的最大CGA含量僅為(6.66±0.58)μg/mL．相比而言，本研究利用通過初步正交優化內生菌培養基的主要成分所獲得綠原酸最大產量為24.02μg/mL，是Magdalena等[20]產量的3.6倍，是菌株XJ-1合成綠原酸初始發酵培養產量(9.9μg/mL)的2.43倍．表明微生物發酵法在合成綠原酸方面存在較大的優勢．

3 結 論

本研究從中藥植物樣本中分離到具有合成綠原酸能力的5株內生菌，5株菌產綠原酸的能力大小為XJ-1＞XJ-3＞XJ-4＞XJ-5＞XJ-2，菌株XJ-1合成綠原酸的產量為9.9μg/mL．形態特征和16S rDNA序列分析鑒定結果表明，菌株XJ-1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)．經過對發酵培養基的初步優化，確定優化后的培養基主要成分為果糖30g/L、檸檬酸銨5g/L、玉米漿6g/L，在此培養基條件下，菌株XJ-1合成綠原酸的產量為24.02μg/mL，是初始發酵培養基的2.43倍．本研究結果為開發產綠原酸工程菌株以及微生物發酵生產綠原酸提供了基礎數據支持.