微小RNA-182-5p通過靶向MAPK1調控MAPK/NF-κB通路治療急性肺損傷的研究

沈曉莉, 莊雪明, 錢夢書, 馬偉雄, 陳月陽, 陸超明, 方旭濤, 王詩波

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院, 1.急診科, 2.胸外科, 江蘇 無錫, 214000)

急性肺損傷(ALI)是由各種直接或間接因素導致肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，進而造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，最終導致的急性低氧性呼吸功能不全的疾病[1-3]。臨床上，ALI好發于膿毒癥、外傷、肺炎等多種疾病中，其中急性全身炎癥反應的肺部特點是肺部浸潤、低氧血癥、肺泡或血管屏障功能障礙。ALI導致的肺水腫可對患者及其家庭造成沉重的負擔[4-5]。因此，深入探討ALI的潛在分子機制并改進目前的治療方法是十分必要的。

微小RNA(miRNA)含有17～22個核苷酸，是在真核生物中表達的一種非編碼RNA, 通過與互補靶位點結合來調節轉錄后的mRNA表達[6-8]。目前miRNA與多種疾病、細胞通路和功能有關，涉及分化、增殖和存活等機制。研究[9-10]顯示循環miR-182-5p對血管平滑肌細胞(VSMC)表型的調節至關重要, miR-182-5p能夠促進VSMC分化并抑制其細胞活力，并且與原發性高血壓的風險相關。研究[11]顯示敲除miR-182-5p能夠上調緊密連接蛋白(TJP)的基因表達，并保護血腦屏障完整性免受甲基苯丙胺濫用導致的損傷。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，而miR-182-5p在ALI中的功能仍然未知。本研究探討ALI中miR-182-5p的表達水平及其對肺纖維化和促炎細胞因子水平的影響，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 ALI模型

本研究選擇6～8周的50只成年雄性C57BL/6小鼠，購自上海斯萊克實驗動物公司[許可證: SCXK(滬)2017-0006; 質量合格證號: 60304257], 在控制溫度和濕度的無特定病原體條件下飼養。向小鼠氣管內滴注1 mg/kg 脂多糖(LPS)[采用磷酸鹽緩沖液(PBS)配置，劑量100 mg/mL]以誘導ALI并生成ALI模型，分別在LPS處理后0、6、12、24、48 h向小鼠腹腔注射100 mL的0.4%戊巴比妥鈉; 開胸，結扎小鼠左主支氣管，取左肺。頸部分離氣管進行插管后，采用PBS灌洗右肺3次, 1 mL/次，回收率>80%。將回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心后獲得上清。本研究所有動物實驗及處置流程均通過本院動物護理和使用委員會的批準。

1.2 細胞培養及分組

RAW264.7細胞和HK-293T 細胞購自中國科學院上海典藏細胞庫，其中HK-293T細胞在Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)(Gibco, 美國)中培養，并添加10%胎牛血清(HyClone, 美國)和1%青霉素/鏈霉素。RAW264.7細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中培養，所有細胞均放置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

RAW264.7細胞共分為6組，分別為對照組(Control)，LPS組, LPS+Ad-GFP+Ad-NC組, LPS+Ad-GFP+Ad-miR-182-5p組, LPS+Ad-MAPK1+Ad-NC組和LPS+Ad-MAPK1+Ad-miR-182-5p組。

1.3 組織病理學分析和肺纖維化測定

肺組織在4%體積比(v/v)的多聚甲醛中固定并包埋在石蠟中，以4 μm厚度切片并用蘇木精-伊紅(HE)溶液(索萊寶，中國)染色以評估病理特征。光學顯微鏡(Nikon Optiphot, 日本)下采用 Masson染色評估肺纖維化的組織學特征，并采用Nikon Digital DS-5 M相機拍照。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

采用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA, 在逆轉錄酶試劑盒(Takara, 中國大連)上對分離的RNA進行逆轉錄，引物序列見表1。qRT-PCR采用SYBR Green MasterMix(Vazyme Biotech, 中國南京)和SYBR Green PCR試劑盒(Takara)。以U6和GAPDH為內參基因進行分析。

表1 各基因引物序列情況

1.5 蛋白質印跡法(WB)

將蛋白提取物通過15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(Bio-Rad，美國)分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, 美國)。每個膜與兔單克隆抗MAPK1抗體(ab183208, Abcam, 美國)、兔多克隆抗核因子κB(NF-κB)、p65抗體(ab16502, Abcam)、兔多克隆抗 IKBα抗體(ab7217, Abcam)或兔單克隆抗GAPDH(ab181602, Abcam)在4 ℃孵育過夜，隨后與二抗在室溫下孵育2 h。最后采用增強型化學發光試劑(ThermoFisher Scientific, 美國)進行顯色。采用Biospectrum-510成像系統(UVP, 美國)進行蛋白質定量。

1.6 熒光素酶報告基因檢測

MAPK13′-UTR熒光素酶報告基因構建體是通過將MAPK1mRNA 3′-UTR克隆到熒光素酶報告基因載體(Promega，美國)。miR-182-5p靶位點突變MAPK13′-UTR 熒光素酶報告基因構建體是通過使用直接位點誘變產生的。進一步將HK-293T 細胞以3×104個細胞/孔接種到96孔板中，并靜置過夜。第2天，采用野生型或突變型報告質粒和miR-182-5p模擬物共轉染細胞。共轉染后24 h, 使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(Promega, 美國)測量相對熒光素酶活性。通過將螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性相除來標準化數據。

1.7 酶聯免疫吸附法(ELISA)

使用云克隆ELISA試劑盒測量BALF中白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和髓過氧化物酶(MPO)的濃度。所有操作按照試劑盒說明書進行。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 ALI肺組織中miR-182-5p和MAPK1的表達情況

本研究通過qRT-PCR分析各處理組肺組織中miR-182-5p和MAPK1的表達，結果顯示miR-182-5p的表達量在LPS處理6 h后迅速增加，并在12 h達到峰值，此后miR-182-5p水平下降，并在24 h達到最低值，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。本研究還評估了LPS給藥后0、6、12、18、24 h肺組織中MAPK1的表達水平，結果顯示MAPK1的表達水平與miR-182-5p的趨勢相反，差異也有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

A: miR-182-5p在肺組織中的表達情況; B: MAPK1在肺組織中的表達情況。與0 h比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.2 miR-182-5p與MAPK1的靶向調控關系

本研究發現MAPK1的表達與miR-182-5p的表達呈負相關。進一步行生物信息學分析預測顯示,MAPK1是miR-182-5p的潛在靶基因(圖2A)。采用含有野生型MAPK13′-UTR或突變體的報告基因進行了雙熒光素酶測定，發現miR-182-5p的過表達抑制了野生型，但不抑制突變型熒光素酶報告基因活性，表明miR-182-5p通過直接結合MAPK13′-UTR特異性靶向MAPK1(圖2B)。細胞實驗結果顯示，轉染Ad-miR-182-5p后, miR-182-5p水平上調(圖2C)，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。進一步檢測轉染Ad-miR-182-5p后,MAPK1mRNA和MAPK1蛋白質表達下調(圖2D、E、F)，差異也有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

A: miR-182-5p與MAPK1的潛在結合位點; B: 雙熒光素酶報告驗證miR-182-5p與MAPK1的靶向關系;C: 驗證各處理組miR-182-5p的表達; D: 驗證各處理組MAPK1的表達情況;E、F: 驗證各處理組MAPK1蛋白表達水平。與相應對照比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.3 MAPK1作為miR-182-5p的效應靶點作用于生物學功能

進一步行體內實驗對兩者的相互作用進行驗證，HE染色表明對照組的肺部形態特征未發生明顯改變。與對照相比，將Ad-GFP+Ad-NC組與LPS+NC組一起作用于肺部會導致肺部結構破壞和炎癥反應(圖3A)。HE染色結果顯示，與LPS+NC組相比，過表達miR-182-5p能夠減輕LPS對肺組織的損傷，而Ad-MAPK1+Ad-NC與LPS共同給藥增加了肺損傷指數。與Ad-MAPK1+Ad-NC組相比, Ad-miR-182-5p顯著抑制了Ad-MAPK1+Ad-miR-182-5p組的肺損傷(圖3B)。同樣的, Masson染色也證實了這部分結果(圖3C、D)。ELISA檢測促炎細胞因子TNF-α和IL-6發現過表達miR-182-5p能抑制炎癥，而過表達MAPK1逆轉這種抑制作用(圖3E、F)。在反映中性粒細胞活性的MPO中同樣證實了這一結果(圖3G)。上述結果證實Ad-miR-182-5p通過靶向MAPK1產生治療ALI的作用。

A: 各處理組肺組織HE染色結果(放大倍數200倍); B: 各處理組肺損傷指數; C: 各處理組肺纖維化評分情況;D: 各處理組肺組織Masson染色結果(放大倍數200倍); E、F、G: 驗證各處理組炎癥因子表達情況。

2.4 miR-182-5p通過MAPK/NF-κB通路減輕LPS誘導的肺損傷

本研究采用WB法檢測NF-κB和NF-κB 抑制蛋白α(IκBα)的表達來分析NF-κB通路的活性，結果顯示，LPS處理后能夠顯著增加NF-κB的蛋白質表達并抑制IκBα的表達。然而，LPS誘導的NF-κB和IκBα蛋白表達調節被miR-182-5p的過表達所逆轉。與Ad-MAPK1+Ad-miR-182-5p組相比, miR-182-5p能夠通過調控MAPK/NF-κB通路減輕LPS誘導的肺損傷。見圖4。

A: 各處理組的NF-κB、IκBα蛋白質印跡表達; B: 各處理組的蛋白相對表達量(與相應對照組比較, *P<0.05, **P<0.01)。

3 討 論

本研究發現miR-182-5p的表達在ALI后0～6 h顯著升高，而在12 h后下調,MAPK1的表達水平呈現出相反的趨勢。此外，miR-182-5p通過靶向MAPK1表達抑制LPS對肺損傷指數、肺纖維化及促炎細胞因子水平的作用，這種作用是通過MAPK/NF-κB通路發揮生物學效應。

目前研究[12]發現miRNA可以與3' UTR(非翻譯區)的mRNA結合，通過與mRNA中部分互補的靶位點相互作用，在轉錄后抑制其表達。miRNA在大量疾病中扮演著重要角色，本研究發現并驗證了miR-182-5p對肺損傷的治療作用，這一發現與目前的一些研究[13-15]相似。進一步研究發現這種治療作用可能是通過抑制MAPK1的表達產生的。盡管有研究[16-18]報告了MAPK1對心臟損傷的治療作用，但本研究結果發現MAPK1加速了ALI的進程，這一現象同樣得到了其他研究數據的證實。研究[19-20]顯示, PD98059作為選擇性MAPK3/MAPK1抑制劑，能夠有效減輕小鼠的ALI。在其他損傷研究領域中同樣發現在脊髓損傷模型中抑制MAPK3/MAPK1可降低創傷的嚴重程度和細胞凋亡[21]。上述結果能夠為本研究的治療效果提供合理的解釋。

最后，本研究發現LPS處理后各組促炎細胞因子IL-6、TNF-α和MPO的表達顯著上調，而過表達miR-182-5p能夠有效抑制這種由LPS誘導的炎癥反應; 進一步檢測發現這種抑制作用被MAPK1過表達所逆轉，這些結果證明miR-182-5p通過靶向調控MAPK1發揮治療作用。此外，本研究采用WB法檢測NF-κB和IκBα的表達來分析NF-κB通路的活性，發現miR-182-5p能夠通過調控MAPK/NF-κB通路減輕LPS所誘導的炎癥反應及肺損傷。

綜上所述, miR-182-5p通過抑制MAPK/NF-κB 信號通路在ALI中發揮治療作用，本研究數據或可有助于深入了解ALI的潛在分子機制和治療新方法的開發。