丹參、澤瀉對NAFLD大鼠脂代謝及PPARα基因表達(dá)的影響*

石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校

路 帥 郭建利 彪雅寧△ 陳 健△ 石 鋮△ 韓 雪△ (石家莊 050599)

提要 目的：探究丹參、澤瀉對非酒精性脂肪肝(NAFLD)的可能作用機制。方法：將60只Wista大鼠隨機分為6組：正常組、模型組、東寶甘泰組和丹參水煎劑組、澤瀉水煎劑組、丹參-澤瀉(丹澤)水煎劑組。通過喂飼高脂飼料建立NAFLD模型，同時給予相應(yīng)藥物治療。8周后，檢測各組大鼠血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平及過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)mRNA表達(dá)，HE法觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：各用藥組均能明顯改善血脂和肝功能 (P<0.01)，升高肝組織PPARα mRNA的表達(dá)(P<0.01)，尤以丹澤組降脂作用更為明顯。結(jié)論：丹參、澤瀉和丹澤水煎劑能顯著改善NAFLD大鼠脂代謝紊亂，改善肝功能，其機制可能與增強肝組織中PPARα mRNA表達(dá)有關(guān)。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明確損肝因素外所致的以肝細(xì)胞呈現(xiàn)較大空泡性脂肪變性和脂肪大量蓄積為基本特征的病理綜合征[1]。近年來隨著人們生活水平提高，NAFLD發(fā)展迅速，且發(fā)病趨于年輕化，在我國患病率約為15.0%，已成為我國第一大慢性肝病[2-3]。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是核受體超家族成員中由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，有過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)、PPAR-β/δ和PPAR-γ3種亞型，其中， PPARα對白色和褐色脂肪代謝有直接或間接的調(diào)節(jié)作用，促進能量與脂肪的代謝，進而減少脂質(zhì)沉積[4-6]。研究表明， NAFLD大鼠采用PPARα激動劑干預(yù)后，大鼠血脂和肝功能得到明顯改善[7]。

目前臨床治療NAFLD仍是以調(diào)整生活方式為主，缺乏特異性治療藥物。現(xiàn)代醫(yī)家多選用減肥藥、調(diào)脂藥、胰島素增敏劑、抗氧化劑等藥物，但長期服用會加重患者肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肌毒性、足部水腫、充血性心力衰竭而限制了臨床應(yīng)用[8]。近年報道表明，中醫(yī)藥治療NAFLD療效顯著，且毒副作用較小，在緩解慢性肝病、減少脂質(zhì)增生方面具有獨特的作用。

丹參活血祛瘀，可改善肝臟微循環(huán)，擴張血管，抗肝纖維化，對肝臟有保護作用[9]；澤瀉利水滲濕、化濁降脂，其提取物及其萜類成分具有調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化等作用[10]。筆者在查閱中醫(yī)藥治療NAFLD的用藥規(guī)律相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，丹參、澤瀉為治療NAFLD用藥頻率最高的前2名[11]，故本研究采用丹參-澤瀉治療NAFLD模型大鼠，觀察脂代謝、肝功能指標(biāo)及PPARα mRNA表達(dá)，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 丹參、澤瀉飲片購自河北省石家莊市樂仁堂藥店，水煎然后濃縮至所需濃度；東寶甘泰片(批號：090504)用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制；膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物與分組 60只SPF級Wista大鼠，雄性，體質(zhì)量為200～220 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號為1003046。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機分為6組：正常組(C)、模型組(M)、丹參水煎劑組(S，5 g/kg)、澤瀉水煎劑組(R，3.33 g/kg)、丹參-澤瀉(丹澤)水煎劑組(SR，8.33 g/kg)、東寶甘泰組(DBGT，1.25 g/kg)。每組10只。

1.3 造模與給藥 正常組大鼠喂飼普通飼料，其余各組均喂飼高脂飼料[9](配方：88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+1.5%膽固醇+0.5%膽鹽)，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心加工。造模同時，給藥組給予相應(yīng)藥物治療，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，每日1次，給藥體積為1 mL/100 g，連續(xù)8周。

1.4 標(biāo)本采集 于最后1次灌胃后，禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉大鼠，股主動脈取血于試管中，離心分離血清，冷貯以備血清指標(biāo)檢測；迅速剖取1份適宜大小肝組織用4%多聚甲醛固定以備病理形態(tài)學(xué)的觀察；另取1份肝組織于凍存管中以備肝組織PPARα mRNA檢測。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 血脂測定：酶法測定血清中TG、TC、FFA的含量，以上操作均嚴(yán)格按試劑盒說明進行。

1.5.2 肝功能測定：賴氏法測定血清中AST、ALT的活性，以上操作均嚴(yán)格按試劑盒說明進行。

1.5.3 HE染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)：經(jīng)甲醛處理的肝組織進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5.4 RT-PCR法檢測：檢測肝組織PPARα mRNA的表達(dá) Trizol法提取總RNA，引物序列由primer5.0軟件設(shè)計，實驗重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參計算相對含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂的變化情況 模型組大鼠血脂含量明顯高于正常組和用藥組(P<0.01)，其中，澤瀉及丹澤水煎劑組血清TG含量明顯低于東寶甘泰組 (P<0.01)，丹參、澤瀉及丹澤水煎劑組血清FFA含量明顯均低于東寶甘泰組(P<0.01)，差異均有非常顯著性。詳見表1。

表1 各組大鼠血清TC、TG和FFA含量的組間比較

2.2 各組大鼠血清ALT和AST的活性變化 模型組大鼠血清ALT和AST的活性明顯高于正常組和給藥組(P<0.01)，其中，丹參、澤瀉及丹澤水煎劑組ALT活性均顯著低于東寶甘泰組(P<0.01)，丹澤水煎劑組AST活性明顯低于東寶甘泰組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清ALT和AST活性的組間比較

同項比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 各組大鼠肝組織PPARα mRNA的表達(dá) 模型組大鼠肝組織PPARα mRNA的表達(dá)明顯低于正常組和給藥組(P<0.01)，東寶甘泰組、丹參組和澤瀉組中PPARα mRNA的表達(dá)明顯低于丹澤組(P<0.01)。見圖1、圖2。

注：與模型組比較，** P<0.01；與東寶甘泰組比較，##P<0.01。

注：1.C組；2.M組；3.S組；4.R組；5.SR組；6.DBGT組。

2.4 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變 正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無脂肪變性。模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫，脂滴空泡多見，各給藥組可改善肝臟脂肪變性。

3 討論

NAFLD患者通常無顯著特征，部分患者表現(xiàn)為全身乏力、腹部脹滿、肝區(qū)隱痛、右上腹不適或脹滿感等癥狀，中醫(yī)學(xué)根根據(jù)NAFLD的臨床表現(xiàn)將其歸屬于 “脅痛”“積聚”“痰濁”“血瘀”等范疇。項目組認(rèn)為NAFLD多由于過食精肥甘甜、所欲不遂、怠惰懶動等致脾運失職，水濕內(nèi)停，聚而為痰；肝失疏泄，氣機不暢，血脈瘀阻，終致痰瘀互結(jié)于肝而發(fā)為本病。故肝脾失調(diào)、痰瘀互結(jié)為其主要病機，化痰祛瘀、健脾調(diào)肝為相應(yīng)治則。現(xiàn)代藥理表明，丹參酮ⅡA可調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠PPAR信號通路，以保護肝臟[12]；丹參酮ⅡA的水溶性衍生物—丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過提高高脂血癥大鼠的抗氧化能力，進而降低血脂[13]；澤瀉的醇提物、水提物均能顯著降低高脂血癥大鼠血脂水平[14-15]；澤瀉醇提取物可通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[16]。因此，本研究選用丹參和澤瀉配伍，探討丹參-澤瀉對NAFLD大鼠的治療作用及其機制。

脂質(zhì)代謝的重要部位是肝臟，長期高脂飲食，大量的FFA從脂肪組織釋放或由腸道吸收直接入血，血中FFA增加，同時肝臟也沉積大量FFA，與膽固醇脂滴結(jié)合為TG，導(dǎo)致肝內(nèi)TG增多[17]。肝臟有一定限度轉(zhuǎn)運TG的能力，當(dāng)合成的量超過這個限度就造成脂肪的蓄積，形成脂肪肝。NAFLD常伴隨著肝損傷，ALT、AST為評價肝損傷的“金指標(biāo)”，能反應(yīng)肝細(xì)胞損傷及程度[18-19]。當(dāng)肝細(xì)胞受損或壞死時，細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST會透過細(xì)胞膜釋放入血，使得血清中ALT和 AST活性急劇升高。

PPARα屬于新型甾體類激素受體，有468個氨基酸殘基，在肝臟、脂肪組織中高度表達(dá)。最新研究表明，PPARα具有調(diào)節(jié)脂代謝作用，進而干預(yù)NAFLD的發(fā)生和發(fā)展。NAFLD患者的外周血單個核細(xì)胞中PPARα表達(dá)高于正常人的2.03～3.31倍, 且肝臟中PPARα mRNA表達(dá)水平與NASH嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[20-21]。當(dāng)PPARα活化，脂肪酸的氧化作用加強，胰島素敏感性也增加，進而影響NAFLD的進展。PPARα調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用涉及以下幾個方面：(1)通過增加脂蛋白脂肪酶的活性，加速TG分解；(2)促進脂肪酸的β氧化[22-23]；(3)通過作用于HDL受體，增加TC的轉(zhuǎn)運；(4)通過降低中性脂質(zhì)在VLDL和HDL之間的交換，加速LDL的清除[24]。此外，PPARα還可以抑制炎癥反應(yīng)的相關(guān)信號通路，進而緩解NAFLD[25]。

本實驗結(jié)果證明，長期喂養(yǎng)高脂飲食可使大鼠血脂含量升高，肝功能受損，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，肝組織PPARα mRNA表達(dá)水平降低；而各給藥組血清TG、TC、FFA、AST和ALT含量或活性較模型組明顯降低，肝組織PPARα mRNA表達(dá)升高，肝臟脂肪變性減輕，提示丹參、澤瀉能夠改善肝功能，調(diào)節(jié)血脂代謝，其機制可能與調(diào)控PPARα的基因表達(dá)、加速脂肪氧化分解有關(guān)。