過磷酸鈣、生物炭、腐殖酸對雙孢菇胞外酶活性和營養成分的影響

方志榮 林 靜 清 源 王雪梅

（1西昌學院資源與環境學院，四川西昌 615013；2西昌學院攀西特色作物研究與利用四川省重點實驗室，四川西昌 615013）

作物秸稈是農作物生產循環中重要的生物質資 源，包括玉米秸稈、稻草、小麥秸稈、油菜秸稈等。我國是農業大國，也是秸稈資源較為豐富的國家之一。國家統計局的資料顯示，2020年我國玉米產量達2.606 7億t，按照玉米籽粒∶玉米秸稈=1.0∶1.2的比例計算，約產生玉米秸稈3.1億t。儲量巨大的玉米秸稈資源若不能得到充分利用，將對循環農業的發展直接起到阻礙作用。

我國早期對玉米秸稈的處理方式主要是焚燒，這樣會帶來嚴重的空氣污染和生態問題。近年來，隨著有關政策的實施，農民已經轉變了傳統的秸稈處理方式。目前，秸稈資源的主要利用方式為秸稈還田、能源化、飼料化、基料化、原料化等，以四川省為例，秸稈還田占資源總量的44%，基料化的比例為5.2%[1]。雖然秸稈還田短期內在一定程度上可以改良土壤的物理性質與土壤內部的生態環境，增加土壤微生物的多樣性，提高耕地的生產力，但由于玉米秸稈結構復雜，碳氮比高，不易降解，從長遠角度看，將影響土壤墑情和耕作。此外，未腐爛的玉米秸稈將大量的致病菌和蟲卵帶入土中，造成致病菌和蟲卵大量繁衍，給下茬作物的生長帶來不利影響。

雙孢菇（Agaricus bisporus（Lange） Sing.）又稱蘑菇、雙孢蘑菇等，屬真菌門擔子菌綱傘菌目蘑菇科蘑菇屬大型真菌，是世界上栽培地域最廣、生產規模最大、產量最高的一種食用菌，其產量約占食用菌產量的40%，也是我國目前出口量較大、創匯較多的食用菌產品之一[2]。

劉順德等[3]研究表明，玉米秸稈中含有粗灰分6.26%～6.74%、粗纖維37.94%～39.10%、木質素32.01%～32.38%，有機物含量高達90.73%～90.95%。相關研究表明，雙孢菇能夠通過胞外酶的作用降解玉米秸稈中的木質素和纖維素，產生的子實體能為人類提供營養成分和多種藥用成分。因此，以玉米秸稈作為雙孢菇的培養料經濟效益巨大[4-6]。

目前，雙孢菇栽培主要采用發酵料栽培技術，發酵方法有一次發酵[6-8]、二次發酵[5，9]、隧道發酵[10-11]等。相比一次發酵（秸稈發酵），二次發酵和隧道發酵不僅提高了整個菇棚的消毒程度，雙孢菇單產水平也有不同程度的提高[9-11]。在一次發酵過程中，微生物發酵常常會使物料產生大量氨氣；在二次發酵或隧道發酵過程中，當發酵溫度維持在45.0～46.0℃時，會產生大量放線菌，發酵產生的氨氣在有氧條件下被放線菌固定，降低了培養料中氮的損失[9-11]。然而，二次發酵特別是隧道發酵技術要求高，一次發酵具有成本低、便于在廣大農村地區推廣等優點。因此，開展一次發酵對于廣大農村玉米秸稈基質化及鄉村振興具有重要意義。一次發酵過程中，如果發酵料中存有氨氣，對雙孢菇菌種危害極大，易使雙孢菇菌種不能萌發成活。傳統除氨的做法是高溫時（60℃）在1 m左右的空中用鐵鍬等抖動發酵混合物散氨，然后攤開降溫。這樣不僅導致大量氨氣散發到空氣中，引起環境污染，而且會造成發酵料氮的損失，降低發酵料的質量。

過磷酸鈣是食用菌生產中常用的輔料。過磷酸鈣不僅可以補充培養料中磷、鈣含量，而且可以促進微生物的分解活動，有利于培養料的發酵腐熟[12]。此外，過磷酸鈣含有的游離酸可與氨反應，是潛在的堆肥揮發氨氣回收固定的吸附劑[13]。吳娟[14]研究表明，添加物料干重10%以上的過磷酸鈣可以顯著降低堆肥過程中NH3等的排放，增加堆肥產品中30%總碳含量以及40%總氮含量。李 帆等[15]研究表明，添加物料干重5%～15%的過磷酸鈣可以有效抑制堆肥過程中銨態氮的揮發損失，增加堆肥的全氮和全磷含量。劉 微等[16]研究表明，秸稈炭具有孔隙度高、比表面積大的優點，有利于堆肥中微生物附著生存，堆肥后秸稈炭表面原-OH官能團含量增加，可以固定堆肥過程中產生的氨，減少堆肥過程中氮的損失。榮榮等[17]研究表明，5%～15%的生物炭能降低堆肥過程中NH3的揮發，并促進保氮過程，氨氣的排放量比對照減少63.75%～92.63%。孔凡克等[18]研究表明，發酵物中加入腐殖酸能提高堆肥中全氮、硝態氮和銨態氮含量，降低氮的損失。現有發酵料栽培雙孢菇技術過磷酸鈣的使用量一般為0～2%[7-9]。已有研究證實，稻草發酵料中加入10%的過磷酸鈣（干質量分數）能顯著提高雙孢菇的產量和品質，但發酵混合物中添加5%以上的過磷酸鈣、過磷酸鈣+生物炭、過磷酸鈣+腐殖酸對雙孢菇胞外酶活性、產量和營養成分的影響尚無報道。

本研究在玉米秸稈發酵料中添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+生物炭、過磷酸鈣+腐殖酸，研究其對雙孢菇不同生長階段胞外酶活性、出菇期、生物學效率、營養成分等的影響，旨在為一次發酵法栽培雙孢菇提供參考。現將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種為雙孢菇W192，購于華沃生物科技有限公司；其他供試材料有金寶貝10型食用菌栽培料發酵助劑（購于北京華夏康源科技有限公司）、生物炭（購于立澤環保科技有限公司）、腐殖酸（購于北京澳佳生態農業股份有限公司）、玉米秸稈（購于西昌市農戶）。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養料發酵處理。將曬干的玉米秸稈用鍘草機切成2～5 cm長的節段，按照預濕、拌料、建堆、翻堆的方法進行培養料發酵，具體過程如下。將玉米節段攤在水泥地上，噴灑1%石灰水，使其慢慢吸入大部分的水分。然后向玉米秸稈中添加過磷酸鈣、生物炭、腐殖酸等：添加秸稈干物質量10%的過磷酸鈣（處理P）；添加秸稈干物質量10%的過磷酸鈣+10%的生物炭（處理P+BC）；添加秸稈干物質量10%的過磷酸鈣+0.25%的腐殖酸（處理P+HA），同時加入稀釋的金寶貝10型食用菌栽培料發酵助劑（發酵助劑按照玉米秸稈干物質量的0.2%加入，并按照1∶25的比例采用玉米面進行稀釋）；添加秸稈干物質量1%的尿素，以不添加過磷酸鈣作為對照（CK）。調節混合物料含水率約為60%，用石灰將pH值調至8～9。將主料與輔料攪拌混勻后，按常規堆置，堆內用直徑10 cm左右的尖頭木棒均勻打孔通氣，用厚膜覆蓋。當料溫上升至65℃左右時，進行第1次翻堆；3～4 d后再次翻倒，翻堆3次，待發酵腐熟料達到黃褐至棕褐色、松軟有彈性、手拉即斷、無臭味、無氨味，即完成培養料的發酵處理，整個發酵過程20 d。

1.2.2 雙孢菇畦栽及管理。在大棚內鋪一層1 m寬的地膜，地膜兩側鋪規格為240 mm×115 mm×53 mm的空心磚作為步道，將發酵好的培養料按照2 kg/m2的用種量采用層播法進行播種。具體做法：先在地膜上方鋪第1層料（厚度10～12 cm），將購買的菌種掰成核桃大小，菌種與菌種之間相距10 cm，呈梅花形擺放，第1層菌種用種量為總量的1/3。按照上述方法鋪第2層料（10～12 cm）、播種第2層菌種（用種量為總量的2/3），再鋪第3層料（厚度3～5 cm），上層覆蓋地膜發菌。

播種后30 d，雙孢菇菌絲布滿料層，去掉地膜并覆土。覆土材料為地表耕作層0～20 cm的土壤，去掉上層的枯枝落葉后風干破碎，過1 cm孔篩，拌入1%石灰粉，混勻起堆悶2 d后備用。在料面上鋪3 cm左右厚的土，覆蓋后澆水，使覆土手抓成團、放手即散（即土壤濕度達65%左右），再用地膜覆蓋畦床，待雙孢菇菌絲體伸出土層時，揭去地膜，進行出菇管理。

1.3 生物學相關指標及酶活性測定

1.3.1 菌絲體生長階段相關指標測定。

（1）采樣。采用交叉五點取樣法，用柱狀土壤采集器采集3層培養料（原基生長階段和子實體生長階段先去掉表層覆蓋土），各點樣品采集后混合均勻，采用四分法取200 g樣品用于胞外酶分析，測定營養生長期菌絲體羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶的活性。

（2）粗酶液的提取。20g發菌料加蒸餾水100mL，25℃下浸提4 h，過濾后，4 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。另取20 g發菌料于80℃的鼓風干燥箱中烘干至恒重，采用上述方法提取上清液作為對照[19]。

（3）羧甲基纖維素酶活性的測定。采用DNS比色法測定[19]，羧甲基纖維素酶的活力單位為在50℃條件下反應1 min產生相當于1 μg分子葡萄糖的還原糖的酶量。

（4）半纖維素酶的測定。采用DNS比色法測定[19]，半纖維素酶的活力單位為在50℃條件下反應1 min產生相當于1 μg分子葡萄糖的還原糖的酶量。

（5）漆酶的測定。采用鄰甲苯胺氧化法測定[19]，將1 g干物質中的酶含量單位時間內使OD600值改變0.01定義為一個漆酶活力單位。

（6）淀粉酶的測定。采用DNS比色法測定[19]，將1 g干物質與底物反應1 min釋放1 μg葡萄糖定義為一個淀粉酶活力單位。

（7）過氧化物酶的測定。采用愈創木酚法測定[19]，將1 g干物質中的酶含量單位時間內使OD470值改變0.01定義為一個過氧化物酶活力單位。

1.3.2 子實體生長階段相關指標測定。待雙孢菇子實體七八成熟時采收，記錄每個處理下雙孢菇的現蕾時間、首次采菇時間、第一潮菇鮮菇產量，計算不同配方的生物學效率，采集第一潮菇進行干物質、總糖和粗蛋白含量的分析。計算公式如下：

生物學效率（%）=鮮菇重/干料重×100

按照上述方法采集發菌料，測定子實體階段菌絲體羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶等胞外酶的活性。

1.3.3 子實體營養成分測定。每處理采集10個子實體，記錄子實體的鮮重，將其放入鼓風干燥箱中105℃烘10 min，后在80℃的條件下烘干至恒重，測其干物質含量。將烘干后的子實體粉碎，過10目篩，材料用于測定粗蛋白含量和總糖含量。粗蛋白含量采用納氏比色法測定[20]。測定總糖時，先采用鹽酸水解[21]，再采用蒽酮比色法測定[22]。

1.4 數據統計與分析

利用SPSS 23.0對胞外酶活性和子實體營養成分進行方差分析，并用LSD進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同處理對雙孢菇菌絲體生長階段和子實體生長階段胞外酶活性的影響

在雙孢菇生長發育過程中，菌絲體會產生羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、過氧化物酶、淀粉酶等，分泌到菌絲體外，將培養料中的纖維素、半纖維素、木質素、淀粉、果膠等大分子物質水解成小分子物質，以供菌絲體、子實體吸收和利用。如圖1所示，與CK相比，處理P、P+BC、P+HA的發酵料顯著提高了雙孢菇菌絲體、原基、子實體生長階段羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶的活性。

圖1 過磷酸鈣、生物炭、腐殖酸對雙孢菇不同生長階段胞外酶活性的影響

羧甲基纖維素酶是一類將纖維素分解為葡萄糖的酶，各處理在菌絲體、原基、子實體生長階段羧甲基纖維素酶的活性大小順序為處理P+HA≈處理P＞處理P+BC＞CK。在原基生長階段，羧甲基纖維素酶的活性提高，CK、處理P、處理P+BC、處理P+HA羧甲基纖維素酶的活性分別較菌絲體生長期提高了2.40倍、1.52倍、1.57倍和1.54倍。子實體生長階段，羧甲基纖維素酶的活性略有降低，CK、處理P、處理P+BC、處理P+HA羧甲基纖維素酶的活性分別較原基生長階段下降了44.90%、4.23%、11.20%、3.49%。

半纖維素酶可將半纖維素分解為五碳糖、六碳糖和糖醛酸，各處理半纖維素酶的活性大小順序在菌絲體生長階段為處理P+HA≈處理P≈處理P+BC＞CK。在原基生長階段，半纖維素酶的活性下降，CK、處理P、處理P+BC、處理P+HA半纖維素酶的活性分別較菌絲體生長期下降了19.3%、65.6%、56.2%、58.5%，各處理半纖維素酶的活性大小順序為處理P+BC＞處理 P+HA＞處理 P＞CK。 CK、處理 P、處理 P+BC半纖維素的活性在子實體生長階段繼續下降，分別較原基生長階段下降了26.0%、29.3%、78.6%；處理P+HA半纖維素酶的活性在子實體生長階段上升，較原基生長階段提高了79.2%；各處理半纖維素酶的活性大小順序為處理P+HA＞處理P＞處理P+BC＞CK，子實體生長階段處理P+HA半纖維素酶的活性顯著高于其他3個處理。

漆酶是木質素分解相關的酶，可將木質素分解為復雜的小分子化合物，各處理漆酶的活性在菌絲體時期最高，其大小順序為處理P＞處理P+HA＞處理P+BC＞CK。在原基生長階段，漆酶的活性下降，CK、處理P、處理P+BC、處理P+HA漆酶的活性分別較菌絲體生長期下降了 42.60%、32.50%、28.94%、20.12%，各處理漆酶的活性大小順序為處理P≈處理P+HA＞處理P+BC＞CK。在子實體生長階段，漆酶的活性繼續下降，CK、處理 P、處理 P+BC、處理 P+HA漆酶的活性分別較原基生長階段下降了72.7%、76.5%、78.3%、79.9%，各處理漆酶的活性大小順序為處理P＞處理P+HA＞處理P+BC＞CK。

淀粉酶可將小分子的碳水化合物分解為葡萄糖，各處理淀粉酶活性在原基生長階段最高，而在子實體生長階段下降。菌絲體生長階段，各處理淀粉酶活性大小的順序為處理P+BC＞處理P＞處理P+HA＞CK。在原基生長階段，CK、處理P、處理P+BC、處理P+HA淀粉酶的活性分別較菌絲體生長階段提高了2.04倍、1.96倍、1.01倍、1.19倍，各處理淀粉酶活性大小順序為處理P＞處理P+BC＞處理P+HA＞CK。在子實體生長階段，CK、處理 P、處理 P+BC、處理 P+HA淀粉酶的活性分別較原基生長階段下降了80.6%、80.5%、92.5%、69.5%，各處理淀粉酶活性大小順序為處理P＞處理P+HA＞處理P+BC＞CK。

過氧化物酶是另一種木質素分解相關的酶，可將木質素分解為復雜的小分子化合物，各處理過氧化物酶活性大小順序在菌絲體生長階段為處理P+HA＞處理P+BC＞處理P＞CK。在原基生長階段，過氧化物酶的活性上升，CK、處理P、處理P+BC、處理P+HA過氧化物酶的活性分別較菌絲體生長階段提高了83.8%、17.0%、31.3%、17.0%，各處理過氧化物酶活性大小的順序為處理P+HA＞處理P+BC＞處理P＞CK。在子實體生長階段，過氧化物酶的活性上升，CK、處理P、處理P+HA過氧化物酶的活性分別較原基生長階段提高了9.5%、20.0%、30.8%，處理P+BC過氧化物酶的活性較原基生長階段下降了5.1%，各處理過氧化物酶活性大小的順序為處理P+HA＞處理P+BC≈處理P＞CK。子實體生長階段處理P+HA過氧化物酶的活性顯著高于其他3個處理。

2.2 不同處理對雙孢菇生物學效率的影響

由表1可知，處理P雙孢菇現蕾時間和首次采菇時間較CK、處理P+BC、處理P+HA短，處理P+HA、處理P+BC的現蕾時間和首次采菇時間較晚。處理P+HA第一潮菇鮮菇產量最高，達21.7 kg/m2，生物學效率達24.1%，第一潮菇鮮菇產量表現為處理P+HA＞處理P＞處理P+BC＞CK，生物學效率表現為處理P+HA＞處理P＞處理P+BC＞CK。結果表明：添加過磷酸鈣+腐殖酸、過磷酸鈣+生物炭、過磷酸鈣能提高雙孢菇的產量，其中以添加過磷酸鈣+腐殖酸的效果最好，但其會延遲雙孢菇的現蕾時間和首次采菇時間。

表1 不同處理對雙孢菇生物學效率的影響

2.3 不同處理對雙孢菇營養成分的影響

由表2可知，與CK相比，處理P、處理P+BC、處理P+HA的發酵料顯著提高了雙孢菇干物質、總糖和粗蛋白的含量，干物質大小的順序為處理P+HA＞處理P+BC≈處理P＞CK，總糖含量的大小順序為處理P≈處理P+HA＞處理P+BC＞CK。雙孢菇中含有豐富的蛋白質，各處理的雙孢菇蛋白質含量的順序為處理 P＞處理 P+HA＞處理 P+BC＞CK， 處理 P、P+BC、P+HA的雙孢菇蛋白質含量分別較CK提高了94.0%、21.3%、80.4%。

表2 不同處理對雙孢菇品質的影響 單位：%

3 結論與討論

食用菌胞外酶的活性大小與食用菌的種類、不同生理發育期和培養基的組成等有關[18]。雙孢菇屬于異養型真菌，其自身能通過分解培養料中的纖維素、半纖維素、木質素等獲得生長所需的碳源[5]。因此，雙孢菇胞外酶活性的高低直接影響其對上述物質的降解能力，也影響了雙孢菇的現蕾時間、首次采菇時間、鮮菇產量、粗蛋白含量、總糖含量。本試驗結果表明，發酵料中添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+生物炭、過磷酸鈣+腐殖酸會增加雙孢菇在菌絲體、原基、子實體生長階段羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、過氧化物酶、淀粉酶的活性，能增加第一潮菇鮮菇產量、生物學效率、干物質含量、粗蛋白含量、總糖含量。綜合來看，玉米秸稈發酵料中添加過磷酸鈣+腐殖酸的情況下，雙孢菇生物學效率和粗蛋白含量最高。

雙孢菇對基料的降解是菌絲體和子實體生長發育的基礎，生長發育期內基料中的木質素、纖維素和半纖維素被菌絲體分泌的胞外酶如漆酶、過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶強烈降解[5]，因而胞外酶活性的高低直接影響雙孢菇的生物學效率和營養成分。與不添加過磷酸鈣對照相比，添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+生物炭、過磷酸鈣+腐殖酸處理雙孢菇在菌絲體、原基、子實體生長階段羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、漆酶、過氧化物酶的活性顯著增加，提高了雙孢菇對纖維素、半纖維素、木質素的分解能力，為雙孢菇生長提供了充足的碳源。子實體生長階段需要大量碳源，添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+腐殖酸處理纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、過氧化物酶的活性高于不添加過磷酸鈣對照、過磷酸鈣+生物炭處理，從而為雙孢菇的原基分化、子實體生長提供了充足的碳源，這可能是添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+腐殖酸處理雙孢菇第一潮菇鮮菇產量、生物學效率高于不添加過磷酸鈣對照、過磷酸鈣+生物炭處理的原因之一。李曉博[5]研究表明：雙孢菇生長發育的整個階段纖維素酶和半纖維素酶的活性都很高，其中在出菇階段最高，酶活性變化與纖維素、半纖維素的降解速率成正比；漆酶和過氧化物酶活性在覆土階段達到最大值，此后開始下降，在出菇階段維持在較低水平。本研究中，羧甲基纖維素酶和漆酶的變化趨勢與李曉博的研究結果一致，但是半纖維素酶和過氧化物酶卻表現出不一致的變化趨勢，可能與培養料只進行了1次發酵有關。

楊亞茹等[23]研究表明，在堆肥期和出菇期，宜優先利用半纖維素和纖維素，木質素利用率較低。本研究中，漆酶在菌絲體生長階段活性最高，在原基生長階段活性降低，在子實體生長階段維持在較低水平。但是另外一種木質素降解酶過氧化物酶的活性隨菌齡的增加而增強，并在出菇期維持較高的水平。過磷酸鈣+腐殖酸處理過氧化物酶的活性顯著高于其他3個處理，增加了雙孢菇對培養料中木質素的利用率。此外，在子實體生長階段，不添加過磷酸鈣對照、添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+生物炭處理半纖維素酶的活性下降，過磷酸鈣+腐殖酸處理半纖維素酶的活性提高，過磷酸鈣+腐殖酸處理半纖維素酶的活性在子實體生長階段顯著高于其他3個處理，增加了雙孢菇對培養料中半纖維素的利用。過磷酸鈣+腐殖酸處理提高了過氧化物酶和半纖維素酶的活性，從而增加了雙孢菇對培養料中木質素和半纖維素的利用，為雙孢菇子實體的生長提供了豐富的碳源，可能是其第一潮菇鮮菇產量、生物學效率高于其他3個處理的原因。

除碳源外，雙孢菇的生長還需要充足的氮源，氨基酸、維生素等營養物質的合成均需要氮素的參與。培養料中不同的碳氮比將影響雙孢菇的產量和品質，綜合考慮其適宜的碳氮比為25.4∶1.0[24]。堆肥（發酵料）中加入過磷酸鈣、生物炭、腐殖酸降低了堆肥（發酵）過程中NH3的排放，增加了堆肥（發酵料）中的總碳和總氮含量[14，17-18]。蛋白質含量是評價雙孢菇品質的指標之一，添加過磷酸鈣、過磷酸鈣+腐殖酸處理的發酵料中可能含有更豐富的氮源，從而為雙孢菇的營養生長和生殖生長提供了更充足的營養物質，粗蛋白含量較不添加過磷酸鈣對照顯著提高。過磷酸鈣+腐殖酸處理第一潮菇鮮菇產量、生物學效率、粗蛋白含量較高，可應用于實際生產。

廖劍華[25]研究表明，W192的菌絲在PDA平板上生長的pH值范圍為5～9，適宜生長平板pH值為7。本試驗堆肥后培養料pH值的差異，可能導致W192菌絲在培養料中生長速度存在差異，這可能是過磷酸鈣+生物炭、過磷酸鈣+腐殖酸處理現蕾時間、首次采菇時間較添加過磷酸鈣處理延遲的原因之一。石膏可以補充培養料中的硫、鈣元素，有利于堆肥中游離氨氣的穩定，減少氮素的損失，對pH值具有緩沖作用，生產中可以添加培養料干重1%～2%的硫酸鈣[12]。因此，可在過磷酸鈣+腐殖酸處理的基礎上加入一定量的硫酸鈣，但其對雙孢菇現蕾時間、首次采菇時間、鮮菇產量、生物學效率及營養成分的影響還需要進一步驗證。