菌-藻共生好氧顆粒污泥的穩定性機理

劉 怡,張 冰,時文歆*,朱易春,劉祖文

菌-藻共生好氧顆粒污泥的穩定性機理

劉 怡1,張 冰1,時文歆1*,朱易春2,劉祖文2

(1.重慶大學環境與生態學院,三峽庫區生態環境教育部重點實驗室,重慶 400045；2.江西理工大學土木與測繪工程學院,江西 贛州 341000)

在非曝氣條件下接種好氧顆粒污泥(AGS)和綠藻藻種,經過18d的培養,成功構建了菌-藻共生好氧顆粒污泥系統(ABGS).研究表明,在非曝氣條件下,與傳統的AGS相比,ABGS具有更高的生物活性、除污染效能和機械強度,說明ABGS的穩定性更優.對ABGS的穩定性機理進行分析,發現在顆粒化過程中,胞外聚合物(EPS)特別是緊密結合層EPS(TB-EPS)中蛋白質(PN)含量明顯增加,實驗末期其含量增加至114.4mg/g MLSS,約為AGS的2.8倍.采用三維熒光光譜進一步分析EPS的組分,結果表明TB-EPS中氨基酸、色氨酸、芳香族蛋白質、絡氨酸和色氨酸類物質是維持顆粒結構穩定性的重要原因.在微生物群落結構方面, ABGS的物種多樣性和群落豐富度更高,原核生物綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)、真核生物綠藻門(Chlorophyta)的富集有利于加強系統的穩定性.

菌-藻共生好氧顆粒污泥(ABGS)；穩定性；胞外聚合物(EPS)；微生物群落

好氧顆粒污泥(AGS)是在各種選擇壓的驅動作用下形成的微生物聚集體,具有結構致密、沉降性能優良、可實現同步脫氮除磷以及抗沖擊負荷能力強等優點[1],因而被譽為“21世紀最具發展潛力的污水生物處理技術之一”[2-3].然而許多研究發現在長期運行過程中,顆粒結構易失穩導致出水水質惡化以及機械曝氣能耗過高等弊端制約了該技術的大規模應用[4-6].

近年來,有研究提出將AGS技術與菌-藻共生系統的優勢特征進行耦合,構建菌-藻共生好氧顆粒污泥(ABGS)體系,以克服AGS系統中存在的技術難題.在ABGS系統中,藻類通過光合作用同化CO2和水中污染物,產生的O2被好氧細菌用于氧化有機物,同時產生CO2供給藻類利用,“菌-藻”之間的共生關系有利于實現對廢水中有機物和氮磷的高效去除[7].劉琳等[8]在光照序批式反應器中培養ABGS,發現該系統對于總氮和磷酸鹽的去除效率(50.2%和35.7%)明顯高于AGS系統(32.8%和25.6%).在非曝氣條件下, ABGS系統的除污效能仍然高于AGS系統.季斌等[9]構建的一種自耦合ABGS系統,在非曝氣條件下,在6h內對于有機物、氨和磷的去除率可達92.7%、96.8%和87.2%.上述研究表明,與AGS相比,ABGS的沉降性能更優,系統穩定性更強,能夠在高效去除污染物的同時減少曝氣能耗,降低運行成本.然而,關于ABGS系統穩定性的機理目前尚不明確,亟待進一步研究.

本文通過探究非曝氣條件下ABGS和AGS的理化特性及污染物去除效能,系統分析ABGS和AGS的穩定性差異,并通過考察EPS特性和微生物群落結構的變化規律,揭示ABGS系統穩定性的內在機理.研究結果可為菌-藻共生好氧顆粒污泥技術的實際應用提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 接種微藻與接種污泥

實驗采用小球藻(FACHB-31)和柵藻(FACHB- 416)作為接種藻種,采用實驗室前期培養的成熟AGS作為接種污泥.小球藻、柵藻和接種污泥三者接種體積比為1:2:7.接種后其混合液體積為400mL,藻細胞密度約為106cell/L,懸浮固體濃度(MLSS)約為3.50g/L,污泥體積指數(SVI5)為35.10mL/g,葉綠素a/MLSS比值為0.06mg/g.

1.2 實驗裝置與操作條件

本實驗在2個500mL的錐形瓶中進行.實驗組(Rp)為光照條件下培養的ABGS系統,其光照強度約為200μmol/(m2·s),光照周期為12h亮相/12h暗相,對照組(Rc)為避光處理的AGS系統.2個實驗裝置放置于搖床上,振蕩速度為150r/min,溫度控制為(25± 2)℃.

采用模擬生活污水作為進水,其組成成分為: 600mg/L COD,60mg/L NH4+-N(NH4Cl),10mg/L PO43--P(K2HPO4/KH2PO4),25mg/L Mg2+(MgSO4×7H2O), 30mg/L Ca2+(CaCl2),1mL/L微量元素[10].每天運行2個周期(12h),運行方式包括1min進水、715min振蕩、2min沉降和2min排水.體積交換比為50%,水力停留時間為24h,污泥齡為27d.

1.3 分析項目和方法

取進水和出水水樣沉淀分離后,上清液過0.45μm濾膜再進行水質指標檢測,其中化學需氧量(COD)采用快速消解分光光度法, NH4+-N采用納氏試劑光度法,NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法, NO3--N采用紫外分光光度法, PO43--P采用鉬酸銨分光光度法.取曝氣末期混合均勻的污泥混合液按照標準方法[11]測定MLSS、混合液揮發性懸浮固體濃度(MLVSS)、SVI5等污泥指標.采用數碼相機拍攝污泥的表觀形態,采用掃描電子顯微鏡(SEM, Quattro S,捷克)進一步觀察顆粒污泥的微觀結構.

ABGS中藻類的富集程度通過葉綠素a(Chl-a)的含量進行表征,按照Zhao等[12]方法測量.顆粒污泥的相對強度以污泥的完整性系數來表示,并根據Ghangrekar等[13]方法測量:取一定量的顆粒污泥樣品(25mL)置于150mL量筒中靜沉,收集1min內沉降至量筒底部的污泥,并將其稀釋至150mL;然后將稀釋后的樣品置于200r/min的搖床震蕩5min;隨即置于150mL量筒中靜沉,測定1min內因破碎而未沉于底部的污泥樣品質量占顆粒污泥總質量的百分比,即為完整性系數.根據Li等[14]方法對接種顆粒污泥、Rc和Rp系統內顆粒污泥的EPS進行由外到內的分級提取,分為松散結合型EPS(LB-EPS)和緊密結合型EPS(TB-EPS). EPS樣品中的蛋白質(PN)和多糖(PS)分別采用BCA蛋白質測定試劑盒(Sigma-Aldrich)和苯酚-硫酸法[15]進行定量測定.采用三維熒光光譜儀(FP-6500,日本JASCO公司)記錄EPS樣品的激發-發射矩陣光譜圖(EEM),采用平行因子(PARAFAC)建模處理EEM數據,并使用Matlab R2015a和N-way Toolbox(版本3.20)分析EPS中的熒光組分.

采用16s rRNA和18s rRNA基因高通量測序技術分析接種顆粒污泥、Rc和Rp成熟顆粒污泥中微生物和藻類群落結構的多樣性.采用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒(Omega,美國)提取接種顆粒污泥、Rc和Rp中成熟顆粒污泥樣品的DNA,然后按照Zhang等[10]的方法進行測序處理和生物信息學分析.

本研究中的實驗平行重復3次,結果以平均值和標準差表示.

2 結果與討論

2.1 污泥理化特性

如圖1(a)所示, Rp系統中葉綠素a含量呈現顯著增加后趨于穩定的變化趨勢.葉綠素a/MLSS比值顯著增加,在第18d達到峰值0.41mg/g,隨后趨于穩定(0.41 ± 0.05) mg/g.結果表明,接種藻類在Rp系統內適應良好,不需要補充接種藻類,18d后Rp反應器內藻類與細菌實現了良好的協同共生,形成了穩定的ABGS[8,16],這與Zhang等[17]的研究結果相近.

圖1(b)為反應器內污泥MLSS和MLVSS/MLSS的變化情況.初始接種顆粒污泥MLSS為3.50g/L, MLVSS/MLSS比值為0.76,可生化性高.培養過程中,Rp系統內MLSS不斷增加,隨后趨于穩定(5.25～5.30g/L), MLVSS/MLSS比值增加至0.88; Rc系統內MLSS在前3d略有增加,隨后顯著下降至2.04g/L, MLVSS/MLSS比值降低至0.66.分析認為,在非曝氣條件下, Rc系統內缺氧導致微生物大量死亡,顆粒污泥破碎解體、結構松散,沉降性能較差的污泥易隨出水排出.相比之下,Rp系統內顆粒結構更加致密而穩定.

圖1(c)為反應器內顆粒污泥SVI5的變化情況. Rp系統內污泥的SVI5在接種初期存在小幅波動,隨后下降并穩定在33.90～36.70mL/g之間.Rc系統內的SVI5呈持續增加的趨勢,在實驗末期上升至71.85mL/g.結果表明, ABGS具有良好的沉降性能與可生化性,與之相反的是, AGS的沉降性能未見明顯的恢復跡象.

圖1(d)為反應器內顆粒污泥的完整性系數變化情況.完整性系數數值越低表示顆粒污泥的相對強度越大、結構穩定性越強[18]. Rp內顆粒的完整性系數始終維持在2.9%～4.1%范圍內,在接種初期該值小幅上升后迅速降低至2.9%,說明ABGS系統對非曝氣的培養條件可以進行快速調整和積極響應. Rc系統內顆粒的完整性系數從接種時的3.8%持續增加到16.7%.以上結果表明,非曝氣環境對AGS顆粒穩定性產生了一定負面影響,但ABGS顆粒污泥在非曝氣條件下仍具有良好的顆粒結構穩定性.

2.2 污泥形態特征

由圖2可知,運行9d后Rp系統內顆粒污泥逐漸變為綠色(圖2(a)),說明綠藻在該反應器內適應性良好,生長速率較快.而此時Rc系統內顆粒污泥的邊緣變得模糊(圖2(e)),分析認為在非曝氣條件下缺少適宜的水力剪切力導致了該現象發生.在實驗進行至第54d時, Rp系統內顆粒污泥結構致密、形狀規則(圖2(b)).此時, Rc系統內顆粒污泥結構松散、形狀不規則,部分顆粒污泥的結構出現了解體現象(圖2(f)).

采用SEM進一步觀察實驗末期兩個系統內顆粒污泥的微觀形態.如圖2c所示, Rp中成熟ABGS具有清晰的球形輪廓和致密光滑的表面結構,原生動物附著在顆粒污泥表面,表明出水水質良好[19].由高倍SEM圖可以觀察到Rp中顆粒表面富集了大量的桿狀菌、鏈球菌和結構完整的藻細胞,以及少量的絲狀菌,可見大量的孔隙和通道(圖2d),分析認為孔隙和通道的存在有利于細菌的黏附,能夠促進營養物質、代謝產物和氧氣的傳遞,進而有利于保持較高的生物活性[20].然而, Rc中的成熟AGS表面粗糙不平,中心出現裂解,呈現不規則的顆粒狀結構(圖2g),這與其完整性系數最大的測量結果相一致.由高倍SEM圖(圖2h)可以觀察到Rc中顆粒表面存在短棒狀和球狀細菌,但被大量絲狀菌覆蓋,導致氧氣和營養物質傳質受阻,核心部位被內源降解[21].

圖2 兩個反應器中顆粒污泥的形態學觀察

2.3 污染物去除效能

在反應器啟動階段,兩個系統對于污染物的去除效率均存在波動,這是由于顆粒污泥對非曝氣條件需要一定的適應期.隨后Rp系統中污染物的去除效率明顯提高,并在第18d趨于穩定(圖3).與之相反的是, Rc反應器的去除效率顯著降低.在相同的進水基質條件下(詳見1.2節), Rp中COD、NH4+-N、TN和PO43--P的平均去除效率分別為98.70%、89.81%、87.14%和76.19%,與對照組Rc相比,分別提高了31.08%、23.97%、30.47%、22.17%.以上結果表明,在非曝氣條件下,ABGS對有機物和氮磷等污染物的去除效果明顯優于AGS.

2.4 EPS的變化

2.4.1 EPS含量的變化 由圖4可知,兩個系統內EPS總含量的變化趨勢存在明顯差異. Rp系統中EPS總含量呈持續增長的趨勢,由最初的121.88mg/ g MLSS逐漸增加至155.99mg/g MLSS,其中LB- EPS含量基本維持穩定, TB-EPS含量顯著升高(圖4a). Rc系統中EPS總含量呈持續下降的趨勢,下降至82.55mg/g MLSS,其中LB-EPS含量小幅度增加, TB-EPS含量急劇減少(圖4b).以上結果表明, LB- EPS含量增加、TB-EPS含量減少是顆粒污泥穩定性出現差異的主要原因,并且TB-EPS對顆粒穩定性的貢獻大于LB-EPS[22].進一步分析發現,兩個系統內LB-EPS和TB-EPS中PS含量均未出現明顯變化,而TB-EPS中PN含量變化顯著. Rp中PN含量由最初的85.46mg/g MLSS增加至114.36mg/g MLSS,約為Rc(41.21mg/g MLSS)的2.8倍,研究表明PN在維持顆粒污泥穩定性方面具有重要作用[23],當顆粒污泥PN/PS值在3～8之間[24],顆粒污泥具有較好的穩定性.本研究中, Rp的PN/PS從4.57增加至5.38,Rc的PN/PS由4.57降低至3.64.較高的PN/PS比值表明其污泥表面具有較高的表面疏水性和較低的表面電荷,有助于維持顆粒污泥結構的穩定性[25].

圖4 系統中顆粒污泥LB-EPS和TB-EPS含量及PN/PS的變化情況

2.4.2 EPS組分分析 圖5為接種顆粒污泥、Rc和Rp系統內顆粒污泥的EPS提取物的熒光光譜圖.根據Chen等[26]的分類方法,將熒光光譜圖分成5個區域:區域A(Ex>250,Em>380)胡敏酸類物質;區域B(Ex>250,Em<380)溶解性微生物副產物,主要是蛋白質衍生的氨基酸和色氨酸;區域C(Ex<250, Em>380)富里酸類物質;區域D(Ex<250, 330

圖5 顆粒污泥LB-EPS和TB-EPS的3D-EEM圖譜

如圖6(g-h)所示, TB-EPS中3種組分的熒光強度與LB-EPS相比均有所提高,其中組分1的熒光強度從824.56(LB-EPS)提高至2566.26(TB-EPS),增加了2.11倍,組分2的熒光強度從709.18(LB-EPS)提高至3066.35(TB-EPS),增加了3.32倍.該結果與前面三維熒光圖譜熒光強度對比結果相吻合.此外,可以觀察到在TB-EPS中, Rc中組分1和組分2的熒光強度均低于接種顆粒污泥和Rp中對應組分的熒光強度.結合AGS和ABGS系統中顆粒污泥的理化特性,得出TB-EPS中組分1氨基酸、色氨酸和芳香族蛋白質物質、組分2絡氨酸和色氨酸類物質含量的增加是維持顆粒結構穩定性的重要原因.

2.5 微生物群落結構

3種顆粒污泥中微生物群落的豐富度和多樣性列于表1.3個樣品的物種覆蓋率均大于99%,表明測序結果能較好地反映樣品中微生物分類的真實性.在非曝氣條件下, Rc和Rp中獲得的具有97%聚類相似性的優化序列分別為35805和42742,均大于初始接種顆粒污泥(33813).對比表1中不同污泥樣品ACE和Chao1指數可知, Rp系統中微生物種群豐富度高于Rc.此外, Rp系統中Shannon指數為4.54,高于Rc(4.06)和接種顆粒污泥(3.83), Rp的Simpson指數為(0.028)小于Rc(0.053)和接種顆粒污泥(0.063).以上結果可以得出, Rp系統內物種多樣性、群落豐富度更高,說明ABGS的形成有利于提高物種多樣性和群落豐富度,進而有利于抵御外界不良環境的干擾以及維持系統的穩定性[17].

表1 基于97%相似度聚類的OTU數目以及微生物群落豐富度和多樣性

在門分類水平上,變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)是3個污泥樣品中的主要優勢菌群(如圖7所示).研究表明,這兩類細菌具有較強的降解有機物和氨氮的能力[28].ABGS中綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度由初始接種污泥的2.31%增加至13.15%.綠彎菌門(Chloroflexi)可以與絲狀菌相互纏繞形成穩定的聚合物結構,在污泥造粒過程中可作為核心或載體形成污泥顆粒的初始骨架,加固顆粒污泥的結構穩定性[29]. Rp的ABGS中浮霉菌門(Planctomycetes)的相對豐度由初始接種污泥的0.90%增加至1.85%,約是Rc中AGS(0.62%)的3倍.此類細菌可以亞硝酸鹽作為電子受體,以CO2作為碳源,通過厭氧氨氧化作用獲取能量[30].初始接種污泥中幾乎不存在藍藻門(Cyanobacteria),而ABGS中藍藻門(Cyanobacteria)含量約為1.75%.光照會誘導藍藻生長,但系統內綠藻的生長以及交替的明暗條件限制了藍藻的過度生長[8,31].

在綱分類水平上,γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidia)仍是兩個系統內的優勢菌群,但其相對豐度存在差異.其中, Rc中與EPS分泌有關的γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的相對豐度由接種污泥的56.84%降低至32.59%,這可能是導致EPS含量下降的主要原因(圖4)[32].此外, ABGS中屬于綠彎菌門的厭氧繩菌綱(Anaerolineae)其相對豐度增加了4.7倍.這類細菌可以有效降解碳水化合物[33],同時該類細菌可參與到生物除磷過程中[34].以上結果可以得出,ABGS的形成在一定程度上改變了系統內特征菌群的相對豐度,選擇性地促進或者抑制某些特定的細菌種類,從而構建了穩定的菌藻共生環境.

圖7(c)顯示了Rp系統中的藻類在屬水平上的相對豐度.從屬分類水平上來看, Rp中真核藻類群落主要由綠藻綱的柵藻()和小球藻()組成.對比發現,柵藻()的相對豐度(48.34%)高于小球藻()的相對豐度(37.95%),這與劉琳等[8]研究結果相似.這兩種藻類均具有高效同化氮、磷的能力[35],可在黑暗階段去除COD、氨和磷酸鹽等營養物質[36].此外, Rp中硅藻門(Bacillariophyta)下菱形藻屬()的相對豐度為1.31%,有研究表明ABGS中的快速增長可以促進營養物質的去除[37].因此,ABGS具有良好的去除污染物效能,可能是由于這3種藻屬的富集和生長.本文 ABGS系統中有接近12%的藻類物種未分類,未分類的藻類物種是否影響菌-藻共生體系穩定性,需要進一步研究其種類和功能.

3 結論

3.1 在非曝氣條件下成功構建了ABGS系統,與傳統的AGS相比,ABGS的MLSS穩定在5.25～5.30g/L、SVI5穩定在33.90～36.70mL/g、完整性系數維持在2.9%～4.1%,此外, ABGS對COD、NH4+- N、TN和PO43--P的平均去除率與AGS相比提高了22%～31%,表明ABGS具有更加優良的沉降性能、更致密的結構、更高的生物活性,更優異的除污效能以及更高的機械強度.

3.2 通過分析EPS的含量可知, ABGS中TB- EPS對顆粒結構穩定性的貢獻大于LB-EPS, TB- EPS中的PN含量明顯增加,從85.46mg/g MLSS增加至114.36mg/g MLSS,約為Rc(41.21mg/g MLSS)的2.8倍, PN含量的增加提高了污泥的表面疏水性,有助于微生物相互凝聚以及維持穩定的顆粒結構.

3.3 進一步分析EPS的熒光組分,TB-EPS中氨基酸和色氨酸及芳香族蛋白質物質、絡氨酸和色氨酸類物質是維持顆粒結構穩定性的重要原因.

3.4 與AGS相比, ABGS的物種多樣性和群落豐富度更高,原核生物綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)、真核生物柵藻()和小球藻()是系統中富集的優勢物種,菌藻之間的共生關系有利于加強系統穩定性.

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The stability mechanism of algal-bacterial granular sludge.

LIU Yi1, ZHANG Bing1, SHI Wen-Xin1*, ZHU Yi-chun2, LIU Zu-wen2

(1.Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment, Ministry of Education, College of Environment and Ecology, Chongqing University, Chongqing 400045, China；2.School of Civil and Surveying&Mapping Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China)., 2022,42(4)：1696～1705

A stable algal-bacterial granular sludge (ABGS) system was established rapidly within 18 days by inoculating with aerobic granules and targeted algae (and) under non-aeration conditions. The results indicated that ABGS had higher biological activity, better nutrients removal performance, and higher mechanical strength than the conventional AGS, indicating the superior stability of ABGS. Moreover, the content of protein (PN) in extracellular polymeric substances (EPS), especially tightly bound layer EPS (TB-EPS), was found increasing significantly during the granulation. Specifically, the PN content of 114.4mg/g MLSS at the end of the operation was about 2.8 times higher than that of AGS. Further analysis of EPS components by three-dimensional fluorescence spectroscopy showed that amino acids, tryptophan, aromatic proteins, complex amino acids and tryptophan-like substances in TB-EPS were conducive to maintain the structural stability of granular sludge. In terms of microbial community structure, the ABGS had a higher microbial diversity and community richness than AGS. The enrichment of the prokaryotic Chloroflexi and Planctomycetes, and the eukaryotic Chlorophyta was beneficial to enhance the stability of the system.

algal-bacterial granular sludge (ABGS)；system stability；extracellular polymeric substances (EPS)；microbial community structure

X703

A

1000-6923(2022)04-1696-10

劉 怡(1997-),女,重慶合川人,重慶大學碩士研究生,研究方向為污水生物處理技術.

2021-09-01

國家自然科學基金資助項目(51778172,52000014)

*責任作者, 教授, swx@hit.edu.cn