小薊多糖—諾米林復合涂膜劑制備工藝的優化及對檸檬果實貯藏品質的影響

黎春紅，邱鈴嵐，雷長毅，汪開拓

(重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 萬州 404000)

【研究意義】檸檬[Citruslimon(L.)Burm. F.]為蕓香科柑橘屬常綠小喬木，其果實風味濃郁，含多種維生素、礦物質等微量元素及橙皮苷、黃酮、苦素等功能性物質，極具營養和保健價值[1]。檸檬鮮果通常于秋季集中上市，春夏季節成熟果實的供給量不足，存在供應斷檔期的問題[2]。低溫貯藏可顯著降低檸檬鮮果采后病害發生率并延長供應檔期，但檸檬鮮果表皮或機械傷口處潛伏的褐腐疫霉菌(Phytophthoracitrophthora)孢子仍能在低溫環境中萌發并侵染鄰近果實，從而導致果實大面積褐腐病的發生[3-4]。咪鮮胺、萬香思瑞、抑霉唑、甲基托布津等合成殺菌劑雖可有效抑制采后柑橘或檸檬果實褐腐病的發生，但化學殘留的風險極大地限制了此類藥劑的使用，因此亟待開發綠色高效的檸檬采后保鮮新技術[5-6]。【前人研究進展】可食性涂膜是安全高效的果實采后保鮮處理方案，其可在果實表面形成薄膜，起到物理屏障作用，從而阻止病原菌侵染并調控果實生理[7]。研究表明，應用殼聚糖、海藻酸鈉、植物膠等多糖類材料進行涂膜處理可有效降低柑橘類果實生理代謝水平、誘導果實抗性或直接抑制病原菌生長，從而顯著減少采后果實病害發生率，延長果實貯藏周期[8]。【本研究切入點】菊科植物小薊(Cirsiumsetosum)即小薊草，別名刺兒菜，是典型的藥食同源性植物，小薊多糖是從中提取出的一種高分子有機多糖，無毒、無味且被膜性好，具有作為果實被膜劑的潛力[9]。但單一多糖類涂膜劑也存在成膜穩定性差、抑菌功效有限、作用周期短等弱點，故復合涂膜是改善多糖涂膜劑對采后果實保鮮效果的有效手段[10]。諾米林是檸檬苦素類化合物的最主要苷元之一，是檸檬主要的呈苦物質，具有較強的廣譜抗菌能力[11]；但諾米林暴露于空氣中易發生氧化反應，將其共混入涂膜劑中可提高并延長抑菌作用[12]。【擬解決的關鍵問題】本研究通過分析小薊多糖—諾米林復合涂膜對“尤力克”檸檬果實的保鮮效果，通過響應面分析法確定最佳制備方案，為檸檬鮮果貯藏保鮮及病害防控提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗果實

供試果實為達商業成熟度的“尤力克”檸檬[Citruslimon(L.)Burm. F.]，分別于2017和2018年秋季采摘于重慶市潼南區柏梓鎮匯達檸檬示范種植基地，隨后1 h內運回實驗室。挑選出無病蟲斑、外形規則、表皮光潔呈淺黃綠色、果橫徑在5.5～8.0 cm的一級檸檬鮮果(GB/T 29370—2012)，經純凈水洗去浮塵后，用75%乙醇溶液對果實進行表面消毒后自然風晾干待用。

1.2 試驗設計

1.2.1 復合涂膜劑制備方法 小薊多糖參考聶倩等[13]方法，使用AB-8大孔樹脂從小薊中進行提取。小薊多糖—諾米林復合涂膜劑根據實驗室前期試驗數據(單因素試驗)進行制備[14]，具體步驟如下：將60～70 g小薊多糖、0.2～0.4 g山梨酸鉀、0.02～0.04 g D-異抗壞血酸鈉和0.2～0.3 g甘油單硬脂酸酯溶解于1000 mL無菌水即制得小薊多糖溶液，冷藏備用。同時，將1.8～2.0 g諾米林、1.6～2.0 g低甲氧基果膠、0.2～0.4 g硬脂酰乳酸鈉和0.10～0.12 g二氧化硅溶解于1000 mL無菌水即制得諾米林乳濁液，冷藏備用。最后，取制備好的小薊多糖溶液和諾米林乳濁液按(1∶1)～(3∶1)的體積配比混合至1800 mL，于45 ℃加熱融化，調節pH至5.5，無菌水定容至2000 mL，即可得小薊多糖—諾米林復合涂膜液。

1.2.2 涂膜處理 2017年10月試驗主要探討小薊多糖—諾米林復合涂膜處理對檸檬果實冷藏期間腐爛率及品種的影響，以確定復合涂膜劑制備的最佳工藝參數。將預處理后的檸檬鮮果浸泡于制備好的不同配方配置的復合涂膜劑中10 min后取出，自然風晾干后分裝于0.3 mm厚的PET包裝盒(每個包裝盒頂部預留直徑1 mm的圓形通氣孔6個)。每個包裝盒分裝4 顆果實，并于(4±1) ℃、相對濕度80%～90%的環境貯藏24 w。以沒有涂膜的檸檬果實為對照組1(CK1)，300 mg/L咪鮮胺處理為對照組2(CK2)。貯藏結束后，取鮮樣測定果實腐爛率及品質參數。各處理組40顆果實，重復3次，整個試驗重復2次。

2018年10月試驗著重分析最佳參數下小薊多糖—諾米林復合涂膜處理對檸檬果實冷藏期間的保鮮效果。將檸檬鮮果浸泡于最佳參數下的復合涂膜劑中進行涂膜處理，處理方法、分裝和貯藏條件同前期試驗。處理完成后，檸檬果實同樣于(4±1) ℃條件下貯藏24 w，其間每6 w取鮮樣測定果實各項品質指標。以沒有涂膜的檸檬果實為對照組，2組處理各120顆果實，重復3次，整個試驗重復2次。

1.2.3 主要因素篩選 根據1.2.1中復合涂膜劑制備參數范圍，應用Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken程序，以小薊多糖含量、山梨酸鉀含量、D-異抗壞血酸鈉含量、甘油單硬脂酸酯含量、諾米林含量、低甲氧基果膠含量、硬脂酰乳酸鈉含量、二氧化硅含量、小薊多糖溶液和諾米林乳濁液配比為自變量(表1)，以檸檬鮮果冷藏24 w后的腐爛率為考察值，分析各因素對小薊多糖—諾米林復合涂膜處理效果的影響，以篩選出主要影響因素。

表1 三水平試驗設計

1.2.4 響應面法優化 通過對主要影響因素的篩選，得出小薊多糖、諾米林和復合涂膜劑配比為影響冷藏期間檸檬鮮果腐爛發生的主要因素。以此為基礎，應用Design Expert 8.0軟件中的旋轉中心組合設計功能對復合涂膜劑的制備參數進行優化。以小薊多糖(X1)、諾米林(X2)和復合涂膜劑配比(X3)為自變量，并以+1、0、-1分別表示自變量的3個水平，以腐爛率(Y1)、固酸比(Y3)、檸檬苦素含量(Y4)為響應值，按照表1中的組合條件配制涂膜液分別對檸檬果實進行涂膜處理，處理方法和分裝同1.2.2。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 腐爛率 檸檬果實表面出現霉菌性病斑即記為爛果。腐爛率(%)=(爛果數/總果數)×100%。

1.3.2 固酸比 固酸比(TSS/TA)=可溶性固形物含量/可滴定酸含量。用手持折光儀測定可溶性固形物含量；采用標準氫氧化鈉滴定法測定可滴定酸，結果以檸檬酸百分含量表示[15]。

1.3.3 檸檬苦素含量 取5 mL檸檬汁樣品于三角燒瓶中，加入50 mL乙酸乙酯后超聲30 min，隨后于4 ℃ 5000 r/min離心10 min，取上清于50 ℃下旋轉蒸發至近干，用乙腈溶解定容至5 mL，過0.22 μm濾膜后參照陳靜等[16]的高效液相色譜法對樣品中檸檬苦素含量進行定量。

1.3.4 果實品質指標的測定 果實呼吸強度和乙烯釋放量分別采用氣流法和氣相色譜法進行測定[15]。總糖含量采用斐林試劑滴定法進行測定[13]，總酚含量測定參考Flion-Ciocalteu法[17]，總黃酮按WANG等[15]的方法進行測定；丙二醛含量與相對電導率分別采用硫代巴比妥酸法和電導儀法[18]進行測定；參考Almeida等[19]的方法，采用ABTS自由基清除能力對果實抗氧化能力進行分析，抗氧化能力用奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)當量表示。

1.4 數據處理

采用Design Expert 8.0軟件進行試驗數據分析和二次回歸模型的構建獲得復合涂膜劑制備的最佳參數。方差分析中顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 主要因素篩選結果

以檸檬果實冷藏期間的腐爛率為響應值，對小薊多糖含量、山梨酸鉀含量、D-異抗壞血酸鈉含量、甘油單硬脂酸酯含量、諾米林含量、低甲氧基果膠含量、硬脂酰乳酸鈉含量、二氧化硅含量、復合涂膜劑配比進行三水平試驗。方差分析結果顯示，各因素按顯著性排列為小薊多糖含量(0.0210)>復合涂膜劑配比(0.0231)>諾米林含量(0.0266)>山梨酸鉀(0.0955)>硬脂酰乳酸鈉(0.2386)>甘油單硬脂酸酯(0.2765)>低甲氧基果膠(0.3370)>二氧化硅(0.3881)>D-異抗壞血酸鈉(0.8621)；且小薊多糖含量、諾米林含量、復合涂膜劑配比等因素置信度均高于95%。以此為基礎，選取小薊多糖含量、諾米林含量、復合涂膜劑配比這3個顯著因素做進一步響應面分析，以確定這3個因素所對應的最優水平。同時，選取山梨酸鉀0.27 g、D-異抗壞血酸鈉0.03 g、甘油單硬脂酸酯0.22 g、低甲氧基果膠1.67 g、硬脂酰乳酸鈉0.27 g、二氧化硅0.11 g以進行后續優化試驗。

2.2 回歸方程的建立

以檸檬果實冷藏后的品質指標如腐爛率、TSS/TA和檸檬苦素含量為響應值Yi，對試驗數據進行擬合，得到一個二次多項式：Yi= a0± a1X1± a2X2± a3X3± a12X1X2± a13X1X3± a23X2X3± a11X12± a22X22± a33X32

(1)

式中，Yi為預測響應值，小薊多糖含量(X1)、諾米林含量(X2)和復合涂膜劑配比(X3)，a0為截距(常數項)，a1、a2、a3為線性系數，a11、a22、a33為平方系數，a12、a13、a23為交互作用系數。4 ℃下貯藏24 w后，各復合涂膜處理組與對照組檸檬果實的腐爛率、TSS/TA和檸檬苦素含量的實測值見表2。

以此結果為基礎，通過Design Expert 8.0軟件對實驗數據進行二次多項回歸擬合，分別獲得腐爛率、TSS/TA和檸檬苦素含量與復合涂膜劑中小薊多糖含量、諾米林含量及復合涂膜劑配比四因素間的二次多項回歸方程，利用其預測的果實腐爛率、TSS/TA和檸檬苦素含量數值見表2。

2.3 響應曲面的分析與優化

利用Design Expert 8.0軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，得到各因素間的兩兩交互作用對檸檬鮮果腐爛率、固酸比、檸檬苦素含量的響應曲面和等高線圖(圖1～2)。曲面圖可確定各因素的最佳參數范圍，等高線圖則可用于評價各因素間交互效應的強弱[20]。

如圖1-A所示，隨著小薊多糖和諾米林含量的增加，檸檬果實腐爛率呈先降后升的趨勢，當小薊多糖含量在64～66 g、諾米林含量為1.85～1.95 g時，檸檬果實冷藏24 w后的腐爛率較低；而當小薊多糖含量低于62 g或高于68 g，諾米林含量低于1.85 g或高于1.95 g時，果實腐爛率急劇上升。由圖1-C，1-E可知，腐爛率隨復合涂膜劑中配比的增大快速降低，達到最低值后又迅速上升，當復合涂膜劑配比約為2∶1時，腐爛率達到最低值。同時，小薊多糖和諾米林含量的等高線圖近似橢圓形，說明兩因素間的交互作用顯著(P=0.0024<0.05，圖1-B)。

檸檬苦素是柑橘屬植物中具有生物活性的氧化性四環三萜類化合物，其含量的高低直接關系檸檬果實保健價值[21]。圖2-A，2-C反映出涂膜劑中小薊多糖含量對果實檸檬苦素含量影響的曲面圖坡度較為陡峭，表明涂膜劑中小薊多糖含量對果實檸檬苦素含量的影響顯著(P=0.0489<0.05)。圖2-E中響應曲面變化平緩，表明諾米林含量及復合涂膜劑配比兩因素對果實檸檬苦素含量的影響不顯著。

2.4 復合涂膜劑制備工藝優化和最優條件驗證

通過對表2以及圖1～2的結果可知，除檸檬果實固酸比對涂膜劑構成不敏感外，果實腐爛率和檸檬苦素含量均受涂膜劑中小薊多糖含量、諾米林含量及復合涂膜劑配比影響，其中涂膜劑中諾米林含量是影響果實品質的首要因素，其次為小薊多糖含量，最后則為復合涂膜劑配比。根據表2的試驗結果，當設定檸檬果實經冷藏24 w后的腐爛率小于6.2、檸檬苦素含量分別高于250 μg/g、固酸比不低于1時，使用Design Expert對回歸方程求解，優化出當復合涂膜劑中小薊多糖含量為64.65 g，諾米林含量為1.90 g，復合涂膜劑配比為2.01時，有最佳處理效果：腐爛率為6.07%，固酸比為1.15，檸檬苦素含量為268.80 μg/g。

表2 旋轉中心組合設計實驗和預測結果

圖1 試驗交互因素影響檸檬果實腐爛率的曲面圖和等高線圖Fig.1 Surface and contour plots of experimental interaction factors affecting the decay incidence of lemon

圖2 試驗交互因素影響檸檬果實檸檬苦素含量的曲面圖和等高線圖Fig.2 Surface and contour plots of experimental interaction factors affecting the limonin content of lemon

為便于實際生產，將復合涂膜劑制備工藝調整為小薊多糖含量64.5 g，諾米林含量1.90 g，復合涂膜劑配比2。使用此參數核對優化數據可靠性，結果顯示，采用該工藝參數制備的復合涂膜劑對檸檬果實進行涂膜處理能顯著(P<0.05)抑制檸檬果實冷藏期間腐爛的發生，同時該處理下果實固酸比及檸檬苦素含量均明顯高于對照果實，且與咪鮮胺處理的果實無顯著性差異(表3)。同時，模型預測值的相對誤差均在±3%內，無統計學上的差異，說明該模型所得的優化參數可靠，且重現性好。

表3 驗證試驗結果

2.5 復合涂膜處理對檸檬果實貯藏品質及抗氧化活性的影響

由表4可見，冷藏期間檸檬果實呼吸強度和乙烯釋放量小幅下降，抗氧化能力、總糖、總酚及總黃酮呈現先增后降的變化趨勢，丙二醛含量及相對電導率逐漸上升。貯前復合涂膜劑處理可降低果實的呼吸強度和乙烯釋放量，延緩果實MDA含量及相對電導率的上升，保持果實較高的總糖及抗氧化物質(總酚、總黃酮)含量，從而維持果實綜合品質。

表4 復合涂膜處理對檸檬果實貯藏品質及抗氧化活性的影響

3 討 論

近年來，纖維素及其衍生物羥丙基甲基纖維素(HPMC)、魔芋葡甘露聚糖(KGM)、殼聚糖(CTS)、淀粉、海藻酸鈉、果膠等多種多糖類大分子材料均被證實可作為被膜劑用于果蔬采后涂膜保鮮處理[8]。此類多糖類涂膜處理安全性高，能形成微氣調環境從而有效降低果實生理代謝水平，延長果實貯藏周期。但大多數多糖材料具有親水性高、分散性強、易降解、無抑菌作用的缺點，因此在多糖類涂膜劑中加入改性材料或生物活性物質可增強被膜穩定性，提升綜合保鮮作用[22]。例如，在殼聚糖中加入納米纖維素可有效提升砂糖橘和蜜橘果實被膜物質的穩定性[23]；采用經堿液改性的淀粉對草莓進行涂膜處理，較單一淀粉涂膜顯著降低了草莓貯藏期間腐爛率和失重率[24]；而在殼聚糖涂膜劑中添加植物精油則賦予涂膜劑強烈且穩定的抑菌活性，從而有效抑制灰霉菌對采后草莓果實的侵染[25]。在本研究中，甘油單硬脂酸酯作為一種常見的非離子型的表面活性劑，添加入小薊多糖溶液中更有助于小薊多糖的分散；山梨酸鉀和D-異抗壞血酸鈉則可抑制小薊多糖的氧化和變性，提高被膜穩定性[26]。諾米林作為蕓香科植物中重要的三萜類類苦素物質，對毛霉、根霉和黑曲霉等多種真菌具有較強的抑制效果[27]。本研究將諾米林共混于低甲氧基果膠和硬脂酰乳酸鈉組成的乳濁液中，可起到分散和緩釋的作用，最大程度提高諾米林抑菌功效。因此，將小薊多糖分散溶液與諾米林乳濁液共混制得復合涂膜劑既維持了較高的穩定性，也提高了涂膜劑的抗菌活性。配方經過優化，得出當小薊多糖含量64.65 g，諾米林含量1.90 g，小薊多糖溶液與諾米林乳濁液體積配比2.01∶1時，小薊多糖—諾米林復合涂膜處理能顯著降低檸檬鮮果冷藏期間腐爛病的發生，并維持果實較高Vc和檸檬苦素含量。此外，經小薊多糖—諾米林復合涂膜處理的檸檬果實在冷藏24 w后的腐爛率與咪鮮胺處理組果實相比無顯著差異，說明在檸檬采后保鮮中，該復合涂膜具有替代合成殺菌劑的潛力。

采后貯藏過程中，果實細胞膜脂過氧化程度逐漸提高，膜脂氧化產物丙二醛含量和細胞膜透性逐漸上升，最終導致果實發生生理衰老和品質劣變[28]。小薊多糖—諾米林復合涂膜處理顯著降低了檸檬果實在冷藏期間呼吸強度和乙烯釋放量，同時果實丙二醛含量和相對電導率顯著低于而果實的品質參數(如總糖、抗氧化物質含量及抗氧化能力)，顯著高于對照果實，這表明復合涂膜處理可顯著延緩檸檬果實采后生理代謝水平，延緩衰老進程，從而維持果實較高品質和功能性。

4 結 論

本試驗采用三水平試驗及響應曲面優化法，以檸檬果實冷藏期間腐爛率和品質參數為響應值，確定了小薊多糖—諾米林復合涂膜液的最佳制備工藝參數為：小薊多糖64.65 g，諾米林1.90 g，復合涂膜劑配比2.01∶1。在此參數下，果實冷藏24 w后仍可維持較高的食用品質。

小薊多糖—諾米林復合涂膜可顯著降低檸檬果實冷藏期間腐爛率，延緩果實衰老進程和品質劣變速度，進而可有效提升果實商品性并延長果實貯運期。