他克林對脂多糖誘導小鼠睪丸支持細胞炎性損傷的保護作用

蔡金霞，黃明光，胡傳活，張 鑫，梁瑩瑩，紀偉霞，馮 妮，葛晨玲，陳志英，李 珣，王曉曄

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004；2.廣西畜牧研究所，南寧 530001)

【研究意義】養殖場中動物炎癥時有發生，而炎癥的存在對生殖會產生一定影響，如公畜的睪丸炎會抑制精子發生和成熟，降低其質量和繁殖能力[1]；母畜的乳房炎導致泌乳能力下降，致使幼仔斷奶后成活率降低[2]，嚴重時甚至危及母畜生命，影響其利用價值和使用年限[3-4]。睪丸炎多由細菌感染引起，而脂多糖( Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，可引起動物機體組織和細胞分泌炎性因子，動物體內極少量的LPS即可引起廣泛的炎癥反應[5-6]。睪丸支持細胞(Sertoli cells，SCs)是眾多環境污染物作用于雄性生殖系統最重要的靶細胞，也是動物體內和體外試驗中評價雄性生殖系統毒性損傷的良好模型[7]。由于SCs在精子發生過程中發揮著重要作用，因此任何影響或引起其功能異常的因素均可使精子發生異常，進而導致不育[8]。他克林是用于治療阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)的第1種藥物，具有很高的脂溶性，容易透過血腦屏障，具有抑制組織中乙酰膽堿酯酶活性、增加乙酰膽堿含量、作為受體激動劑促進乙酰膽堿釋放、促進腦組織對葡萄糖利用而提高記憶力和學習能力及下調Kv2.1通道表達促進細胞增殖等藥理作用[9]。廣西大學動物科學技術學院動物解剖實驗室研究發現，他克林在豬精子液態保存和冷凍保存方面具有很好的抗凋亡效果[10-11]。但是，目前關于他克林對雄性動物生殖細胞炎性損傷作用的研究鮮見報道。因此，分析他克林對LPS誘導小鼠睪丸支持細胞(Mouse testis sertoli cells，TM4)炎性損傷的保護作用，可為雄性動物生殖疾病相關抗炎藥物的利用及精子質量提高提供更多藥物選擇。【前人研究進展】Hu等[10]研究發現，0.05、0.10和0.15 mmol/L他克林均可顯著或極顯著提高豬精子的凍后質量，其中0.10 mmol/L的處理效果最佳。黃明光等[11]研究表明，他克林對豬精液的常溫和低溫保存具有積極作用，以0.10 mmol/L的處理效果最佳，說明稀釋液中他克林濃度為0.10 mmol/L時能延長豬精子的壽命從而顯著改善其保存效果。SCs具有為生精細胞提供營養、激素轉化、屏障隔離和吞噬等功能，外源性化合物對其影響較明顯[12]。已有研究對女貞子多糖在TM4炎性損傷中能量代謝的保護作用進行探討[13]，但炎癥是一個復雜的病理過程，女貞子多糖是否對TM4代謝功能具有直接調節作用，或者是通過對其他功能(如免疫功能)的調節間接影響代謝功能，還有待進一步探究。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)信號通路是維持組織穩態和防止炎癥病理的關鍵，與細胞存活和凋亡相關[14]，TNF是激活核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的主要細胞因子，同時也能誘導細胞凋亡和壞死[15-16]。Pan等[17]研究表明，SCs的免疫豁免特性為細胞、組織和器官的替代治療提供了新思路，當SCs受到LPS刺激后NF-κB信號通路被激活，相應的閉合蛋白表達下調，SCs細胞表面閉合蛋白內化，血睪屏障完整性遭到破壞；腮腺炎病毒感染小鼠睪丸后會誘導TM4中TNF-α、白細胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)蛋白表達上調，在LPS誘導下，TM4分泌促炎因子TNF-α。Wu等[18]研究發現，在應用NF-κB抑制劑后，TNF-α和IL-6蛋白分泌減少，暗示NF-κB信號通路對這些細胞因子和趨化因子的產生發揮重要作用。【本研究切入點】目前，有關他克林對TM4保護作用相關信號分子(NF-κB、TNF-α和IL-6等基因mRNA和蛋白)表達變化情況的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】以TM4為研究對象，從炎癥角度進一步探索他克林對雄性動物生殖相關細胞的抗炎保護作用，為雄性動物生殖疾病相關藥物的利用及精子質量的提高提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TM4購自武漢普諾賽生物科技有限公司；他克林購自上海相輝醫藥有限公司；LPS購自美國Sigma公司；DMEM/F12細胞培養基、胎牛血清和馬血清購自上海源葉生物科技有限公司；CCK8試劑購自日本同仁化學研究所；IL-6和TNF-α酶聯免疫吸附測定法檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，引物購自華大基因科技有限公司，NF-κB抗體購自美國Abcam公司。

主要儀器設備：CO2細胞培養溫箱(賽默飛世爾科技有限公司)、倒置顯微鏡(CKX31，奧林巴斯科技有限公司)、細胞計數板(上海市求精生化有限公司)、96孔板和6 cm2細胞培養皿(廣州潔特生物過濾制品技術有限公司)、電子分析天平(生物卓精電子科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養 將TM4置于含有抗生素(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)、5%馬血清(HS)和2.5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12細胞培養基中，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養[19]。

1.2.2 LPS對TM4增殖的影響 取生長狀態良好的對數期TM4，以密度為5×103個/mL接種于96孔細胞培養板，置于細胞培養箱培養24 h。小心棄去上清，再加入含不同濃度LPS[0.00(空白組)、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL]的DMEM/F12溶液，分別處理3.0、6.0、12.0和24.0 h后，每孔加入CCK8溶液，用酶標儀于450 nm處測定OD值，并計算細胞增殖率，細胞增殖率大于90.00%表明此濃度的LPS對細胞增殖無明顯抑制作用[3]。將篩選出LPS對TM4損傷的最佳濃度和時間用于后續試驗。

1.2.3 CCK8法檢測他克林對LPS誘導TM4損傷的保護作用 96孔細胞鋪板方法同1.2.2，后續操作如下：在上述1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間基礎上，加入含不同濃度他克林的DMEM/F12溶液進行保護。共9組細胞樣品，組1為未加任何藥物的空白組，組2～9分別為先用1.00 μg/mL LPS誘導損傷12.0 h，再用他克林相應濃度(100 000.00、10 000.00、1000.00、100.00、10.00、1.00、0.10和0.01 μg/mL)對細胞進行后處理，每組6個重復孔。放入細胞培養箱繼續分別加入LPS進行前保護處理0.5、1.0、2.0 h和加入LPS進行后保護處理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h后，每孔加入10.0 μL CCK8溶液。CCK8檢測方法同1.2.2。篩選出他克林對LPS誘導TM4損傷保護作用的最佳濃度和時間用于后續試驗。

1.2.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測IL-6和TNF-αmRNA基因表達情況 試驗分為空白組、LPS組和藥物組共3組，其中，空白組加入DMEM/F12溶液3.0 mL，LPS組加入含LPS的DMEM/F12溶液3.0 mL，藥物組使用1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間處理后，再加入經1.2.3篩選出的他克林最佳保護濃度和時間處理的DMEM/F12溶液3.0 mL繼續培養6.0 h。細胞總RNA提取、反轉錄按照熒光定量試劑盒說明進行操作，以GAPDH為內參基因，分析目的基因的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 TM4炎癥因子表達水平的熒光定量引物序列

1.2.5 ELISA法檢測TM4培養上清中的TNF-α和IL-6蛋白釋放量 按照1.2.4的細胞分組和處理方法提取細胞培養上清中的蛋白樣品，按ELISA試劑盒操作說明進行ELISA檢測。

1.2.6 Western Blot檢測NF-κB蛋白表達 共分析7組細胞樣品，組1為未加入任何藥物的空白組，組2為LPS組(1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間組)，組3為他克林組(1.2.3篩選出的他克林保護濃度和時間組)，組4～7分別為先采用1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時間，再用他克林(0.01、1.00、100.00和10 000.00 μg/mL)后處理6.0 h組。以1.2.4中提取的蛋白為目的蛋白，將配制好的一抗(以抗體∶PBST溶液1∶18 000稀釋)進行免疫印跡，以β-actin為內參蛋白，分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計分析

試驗數據采用SPSS 24.0進行統計，以單因素方差分析進行組間差異性顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 LPS對TM4增殖的影響結果

如表2所示，空白組的TM4增殖情況良好；隨著LPS濃度的升高，100.00 μg/mL LPS誘導處理3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分別為70.00%、66.00%、70.00%和81.00%，均極顯著低于空白組(P<0.01，下同)；隨著LPS處理時間的延長，各濃度LPS誘導處理12.0和24.0 h的TM4增殖率均顯著或極低于空白組(P<0.05，下同)；各LPS濃度及相應誘導時間分別處理的TM4增殖率存在差異，如0.01 μg/mL LPS誘導處理6.0 h的TM4增殖率為110.00%，極顯著高于空白組；而0.10、1.00 μg/mL LPS誘導處理6.0 h的TM4增殖率分別為87.00%和89.00%，極顯著低于空白組；而在所有LPS濃度誘導處理中，1.00 μg/mL LPS誘導處理12.0 h的TM4增殖率最低，為38.00%，極顯著低于空白組。說明隨著LPS濃度的升高和誘導時間的延長，LPS誘導損傷的趨勢逐漸增加，而在不同濃度不同處理時間下，LPS對TM4增殖的影響又存在一定的差異，其中1.00 μg/mL LPS誘導TM4 12.0 h更容易產生炎性損傷。

表2 不同濃度LPS對TM4增殖率的影響

2.2 他克林對LPS誘導TM4損傷的保護作用

如表3所示，10 000.00 μg/mL他克林預處理2.0 h的TM4增殖率為87.00%，顯著低于空白組，10 000.00、100 000.00 μg/mL他克林預處理0.5和1.0 h或后處理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分別為73.00%、68.00%、66.00%、80.00%、81.00%、30.00%、63.00%、75.00%和7.00%、13.00%、29.00%、36.00%、5.00%、15.00%、75.00%、40.00%，均極顯著低于空白組。

表3 不同處理時間、不同濃度他克林對LPS誘導TM4損傷的保護作用(TM4增殖率)

而隨著他克林濃度的降低及時間的延長，如他克林濃度0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL后處理 24.0 h的TM4增殖率分別為117.00%、116.00%、116.00%、114.00%和他克林濃度0.01 μg/mL后處理 6.0 h的TM4增殖率為122.00%，均顯著高于空白組。說明他克林不同濃度、不同處理時間對TM4增殖的影響存在差異，隨著他克林濃度的降低及處理時間的延長，其對TM4的保護作用趨于加強，其中0.01 μg/mL他克林后處理 6.0 h對TM4的保護效果最佳。

2.3 他克林對LPS誘導下TM4 IL-6 和TNF-α基因mRNA表達的影響

如圖1所示，空白組TM4的IL-6(圖1-A)和TNF-α(圖1-B)基因mRNA相對表達量均較低；與空白組比較，LPS組TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相對表達量分別顯著和極顯著上調；與LPS組比較，藥物組TM4的IL-6基因mRNA相對表達量顯著下調，TNF-α基因mRNA相對表達量極顯著下調。說明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相對表達量，從而降低炎癥反應。

#和##分別表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；*和**分別表示與空白組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同Compared with the LPS group，# represented significant difference(P<0.05),and ## represented extremely significant difference(P<0.01).Compared with the blank group,* represented significant difference(P<0.05),and ** represented extremely significant difference(P<0.01).The same as below圖1 他克林對LPS誘導TM4 TNF-α和IL-6基因mRNA表達的影響Fig.1 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.4 他克林對LPS誘導TM4培養上清中TNF-α和IL-6蛋白釋放量的影響

如圖2所示，空白組TM4培養上清的IL-6(圖2-A)和TNF-α(圖2-B)蛋白表達量均較低；與空白組比較，LPS組TM4的培養上清的IL-6和TNF-α蛋白表達量均顯著上調；與LPS組比較，藥物組TM4培養上清的IL-6和TNF-α蛋白表達量均顯著下調。說明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α蛋白表達量，從而降低炎癥反應。

圖2 他克林對LPS誘導TM4培養上清TNF-α和IL-6蛋白表達的影響Fig.2 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.5 他克林對LPS誘導TM4 NF-κB蛋白表達的影響

為探究他克林對LPS誘導TM4 NF-κB蛋白表達的影響，采用WB法檢測經不同濃度他克林處理不同時間后TM4的NF-κB蛋白表達情況。從圖3-B可看出，與空白組(組1)相比，LPS組(組2)TM4的NF-κB蛋白表達量顯著上調；與LPS組相比，他克林濃度為1.00(組5)、100.00(組6)和10 000.00 (組7)μg/mL后處理6.0 h可極顯著上調NF-κB蛋白表達量，而0.01 μg/mL他克林后處理6.0 h(組4)可降低NF-κB蛋白表達量，但差異不顯著(P>0.05)。說明0.01 μg/mL他克林對LPS誘導TM4損傷后處理6.0 h對降低NF-κB蛋白表達量效果不明顯,適當降低他克林濃度或增加保護時間可能效果更佳。

圖3 他克林對LPS誘導TM4 NF-κB蛋白表達的影響Fig.3 Effect of tacrine on NF-κB expression in LPS-induced TM4 cells

3 討 論

他克林是一種西藥，臨床使用始于1993年，是由美國FDA批準上市用于AD治療的第一代藥物之一，具有細胞外老年斑和細胞內神經原纖維纏結2種病理特征[21]。目前對AD的確切發病機制尚不清楚，一般認為炎癥、代謝應激和鈣超載等多種因素參與該病的暴發[22-23]。關于他克林的研究目前已證實其在AD治療方面效果理想，但長時間高劑量服用存在肝臟毒性，而對其他疾病的治療效果有待進一步驗證[24]。已有研究表明，他克林暴露在表達乙酰膽堿酯酶的細胞(例如神經元)中可導致錯誤折疊的乙酰膽堿酯酶在內質網積聚，這種錯誤折疊的酶不能轉運到高爾基體/質膜，從而導致內質網脅迫及其下游的未折疊蛋白信號級聯反應[24]。Liu等[24]研究發現，一旦內質網應激過大，內質網與線粒體的協同作用會增加線粒體膜電位損失，導致暴露于他克林的細胞失去穩態，發生凋亡。鄭鑫[25]也研究發現，他克林通過誘導細胞內活性氧的過量生成和谷胱甘肽耗竭，誘導HepG2細胞DNA氧化性損傷和斷裂，還誘導HepG2細胞的微核形成增加，說明他克林具有遺傳毒性。已知的他克林不良反應還包括肝毒性[25]和消化道反應，且僅對輕度和中度AD癥狀治療有效，對重度癥狀無效[21]。盡管如此，越來越多的證據表明，他克林對凋亡和氧化損傷也有一定的保護作用，且可促進細胞增殖[26-29]。此外，他克林對細胞具有一定的增殖作用，其作用機制可能為K+外流減少引起的去極化可增加胞內Ca2+濃度，加速細胞增殖[30]，因此，他克林可能對Ca2+增加后的細胞凋亡和氧化應激具有保護作用[9]。本研究結果與上述研究結果相似，0.01 μg/mL他克林可減少LPS對TM4造成的炎性損傷，而10 000.00和100 000.00 μg/mL他克林呈現一定的細胞毒性，充分說明他克林的細胞毒性和保護性與其濃度相關；與LPS組相比，藥物組的NF-κB蛋白表達量略低，但差異不顯著，再稀釋10或5倍梯度或者增加保護時間對TM4炎性損傷的保護作用可能更好。

他克林的化學結構是平面、親水性結構，很容易通過血腦屏障，且血腦屏障、血睪屏障和其他血液組織屏障均具有限制水、電解質、離子、激素、旁分泌因子和其他外源生物分子的細胞旁(細胞間)和跨細胞擴散的共同特征，產生這些屏障的結構蛋白相似，在功能上也有相似之處[31]。如生物活性肽(F5肽、NC1肽、Lg3肽、Lg4肽和Lg5肽)可能在血腦屏障和其他血液—組織屏障中發揮作用，這些生物活性肽及其下游信號蛋白也可能影響其他血液—組織屏障的細胞旁和跨細胞藥物擴散[31]。基于上述研究結果，本研究中他克林對TM4炎性損傷的保護作用機制可能是：①抑制TM4中乙酰膽堿酯酶活性，增加乙酰膽堿含量；②作為TM4中某種受體激動劑，促進乙酰膽堿釋放；③促進TM4對葡萄糖的利用，促進細胞增殖；④減輕TM4凋亡，從而改善炎性損傷。他克林改善TM4炎性損傷的具體機制是否與其對神經細胞的作用機制相似，或是否通過穿過血睪屏障產生相應的作用有待進一步探究。

曾有研究發現，LPS抑制細胞活力呈現濃度依賴性[32]且炎癥可使IL-6蛋白含量顯著升高[33]，但本研究發現，LPS抑制細胞活力不僅與抑制濃度和時間關系密切，且其誘導的TM4中TNF-α和IL-6基因mRNA和蛋白表達量顯著升高，推測他克林能通過調節TM4分泌TNF-α和IL-6等炎癥蛋白從而影響炎癥反應。目前對于他克林的探索大多基于他克林的平面、親水性結構進行多功能藥物設計，采用多靶點定向配體方法有望開發出有效的新藥[34]。基于藥物開發史上“老藥新用”(由于發現新的作用機制，而不是增加適應癥)的成功范例，他克林的多重作用及其可能的生理意義值得進一步探討，從而為雄性動物生殖系統疾病的治療乃至精子的生產和保存等提供更多的藥物選擇。

4 結 論

LPS對TM4增殖產生一定的影響，其中1.00 μg/mL LPS誘導處理12.0 h易于產生TM4炎性損傷；他克林對TM4炎性損傷具有一定的保護作用，其中0.01 μg/mL后處理6.0 h的保護作用最佳，其保護作用可能與IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表達量下調有關。