銅鋅交互效應對方格星蟲稚蟲生長和生理機能的影響

許明珠，董蘭芳，李恒慧，李世才，陳瑞芳，張 琴，彭慧婧，龍子揚，林立蔚

(1.廣西海洋研究所有限責任公司/廣西海水養殖新品種繁育工程技術研究中心，廣西 北海 536000；2.合浦縣水產技術推廣站，廣西 合浦 536100；3.廣西科學院，南寧 530007；4.廣西民族大學海洋與生物技術學院/廣西多糖材料與改性實驗室/廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，南寧 530006)

【研究意義】方格星蟲(Sipunculusnudus)又稱光裸方格星蟲、光裸星蟲、沙蟲，是一種具體腔、不分節的海洋蠕蟲，隸屬于方格星蟲科方格星蟲屬，在我國主要分布于熱帶和亞熱帶海域，尤其以廣西沿海資源最豐富[1]。方格星蟲營養豐富，蛋白含量達79.90%，且含有20種脂肪酸和多種微量元素，兼具藥理作用，深受消費者追捧，是廣西沿海一種重要的海洋經濟生物[2-5]。自2008年廣西海洋研究所有限責任公司突破規?；斯っ绶N技術以來，在廣西和廣東沿海地區掀起了方格星蟲養殖熱潮。目前市場上尚未研發出一款經濟高效的方格星蟲配方飼料，方格星蟲仍以灘涂粗放養殖模式養殖為主，產量難以滿足市場需求，其產品價格日益增高。廣西海洋研究所方格星蟲研究團隊長期致力于方格星蟲飼料營養研究，已完成三大營養元素、糖源及單一微量元素最適含量探討。營養元素間存在復雜的相互促進和抑制作用，銅和鋅是方格星蟲生長發育的必需微量元素，受環境因素脅迫較多，但對其相互作用了解甚少。因此，開展微量元素銅鋅交互效應對方格星蟲稚蟲生長和生理機能影響研究，對研發人工配合飼料以促進方格星蟲養殖產業的可持續發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】銅是血液中血藍蛋白的重要組分，也是機體中細胞色素C氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)的組分，參與營養代謝和免疫等系列重要機體功能[6]。與無機礦物質相比，養殖動物對有機螯合礦物質的吸收率更高，常作為有效銅源添加至飼料中[7]。已有研究表明，飼料中適宜含量的銅能提高日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)幼蝦的生長性能和免疫力，其血藍蛋白的表達顯著受飼料銅添加量影響，同時飼料銅和鋅添加量均可影響日本沼蝦生長、抗氧化和免疫性能，并在抗氧化和免疫性能方面存在交互效應[8]；飼料中添加10.0 mg/kg銅元素可顯著提高斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的增重率，并降低飼料系數，且具有最高的血C銅和鋅—SOD活性[9]。同樣，鋅廣泛分布于機體內中，素有有“生命元素”之美稱，是機體內多種金屬酶的組成成分或激活劑，參與機體生長代謝、抗氧化和免疫等生理過程[10]。飼料中添加鋅對方斑東風螺(Babyloniaareolate)[9]的生長具有明顯影響，其軟體部分鋅含量隨著飼料鋅添加量的增加而顯著增加，并顯著影響其內臟團中多種酶的活力。仲曉麗[11]研究表明，飼料銅和鋅交互僅對皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)的軟體部蛋白含量、肝胰臟AKP酶活性和鐵元素含量具有顯著影響，并表現出一定的協同作用。李俊偉等[12]通過開展方格星蟲礦物質元素組成及其生物富集特征研究，發現方格星蟲對不同元素的生物富集能力不同，體壁銅元素和鋅元素含量分別為2.8和8.4 mg/kg；本研究團隊前期開展方格星蟲稚蟲飼料銅元素和鋅元素單因素試驗證實，方格星蟲稚蟲飼料適宜的銅添加水平為7.5～11.2 mg/kg[13]，適宜的鋅添加水平為43.7 mg/kg[14]。銅和鋅是同一副族元素，在化學性質上具有較多相似之處，且二者雜化軌道的化合價相似，致使這2種元素在吸收和金屬酶合成時互相競爭蛋白的親和部位，導致彼此間產生拮抗作用[15-17]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對方格星蟲飼料銅鋅交互影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以蛋氨酸銅為銅源、蛋氨酸鋅為鋅源，設計3×3雙因素正交試驗，探討銅、鋅交互效應對方格星蟲稚蟲生長和生理機能的影響，確定飼料中的銅和鋅適宜添加量，以期為開發高效環保的方格星蟲人工配合飼料提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試方格星蟲稚蟲采自廣西北海市廣西海洋研究所有限責任公司海水增養殖基地，為同批人工孵化苗種，平均體重(14.43±0.21)mg/條，自然狀態下體長為1.21～1.67 cm。制作飼料前，分別對各原料進行蛋白、脂肪和能值測定，作為制定和調整飼料配方的依據。試驗用基礎飼料主要由酪蛋白、明膠、魚油、糊精、卵磷脂、褐藻酸鈉、微晶纖維素、維生素預混料和礦物質預混料組成，并用蛋氨酸銅和蛋氨酸鋅調節試驗飼料中的銅和鋅元素含量(表1)。根據方格星蟲銅、鋅單因素試驗結果，以適宜銅添加水平為7.5～11.2 mg/kg，適宜鋅添加水平為43.7 mg/kg為基準，低于適宜添加量為低含量飼料，高于適宜添加量為高含量(過量)飼料。分別向基礎飼料1～3號、4～6號和7～9號添加29.4、58.8和117.6 mg/kg蛋氨酸銅，換算成銅添加量分別為5.0(Cu1)、10.0(Cu2)和20.0(Cu3)mg/kg。添加蛋氨酸銅后，1、4和7號飼料添加蛋氨酸鋅21.1 mg/kg，2、5和8號飼料添加蛋氨酸鋅42.1 mg/kg，3、6和9號飼料添加蛋氨酸鋅84.2 mg/kg，換算成鋅添加量分別為20.0(Zn1)、40.0(Zn2)和80.0(Zn3)mg/kg(表2)。飼料制作過程：先將主要原料粉碎過100目篩，按照添加量從少至多逐級稱重并混合均勻，與魚油搓勻后再加少量水搓勻，烘干粉碎制成過100目篩的微顆粒飼料，裝袋標號備用。

表1 試驗飼料基礎配方及營養成分(干物質)

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 養殖時間為2018年8—10月，養殖周期為8周。選用相同規格(65 cm×55 cm×45 cm)的27個水槽，在水槽底部均勻鋪設1層(厚3～4 cm)細砂，用淡水徹底清洗消毒并經海水浸泡1 d，加入海水約40 cm，此為方格星蟲稚蟲的棲息地。選用健康無病、同一批次繁育的方格星蟲稚蟲8100條，以300條為1個重復，3個重復1組，隨機分成9組，分別飼喂9種水平銅和鋅元素混合的人工微顆粒飼料(處理1～9)。投喂方法為過量投喂，即保證沙子表面有少量未食用完全的餌料。飼養采用自然光照周期，24 h連續微充氧，水溫維持在26～30 ℃，鹽度維持在18‰～22‰，溶解氧大于5.0 mg/L。

表2 各處理飼料的銅和鋅添加量

1.2.2 測定項目及方法 飼養結束后，將方格星蟲稚蟲轉移至盛有海水(水深約10 cm)的無沙水槽中停食排沙24 h后稱量各組總重，同時記錄稚蟲存活數量，計算各處理組方格星蟲稚蟲存活率。

存活率(Survival rate，%)=Nt/N0×100；

增重率(Weight gain rate，%)=(Mt-M0)/M0×100；

特定生長率(Specific gain rate，%)=(lnMt-lnM0)/t×100

式中，Nt為終末稚蟲條數，N0為初始稚蟲條數，Mt為終末平均體質量，M0為初始平均體質量，t為試驗天數。

稚蟲體成分和飼料常規成分采用AOAC[18]的方法進行測定，稚蟲蟲體勻漿液堿性磷酸酶(AKP)活性(U/mg)參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明進行測定，蟲體鋅和銅元素含量采用GB/T 13885—2003《動物飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定 原子吸收光譜法》的方法進行測定。

銅鋅交互效應采用折線圖表示，折線相交即為飼料銅和鋅添加量對其具有顯著交互效應，折線不相交即為飼料銅和鋅添加量對其無交互效應。

1.3 統計分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行統計和方差分析，以Tukey’s進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 銅鋅交互效應下方格星蟲稚蟲的生長性能

由表3可知，經過8周的飼養，不同水平銅和鋅處理組方格星蟲稚蟲的終末體重、增重率和特定生長率均顯著提高(P<0.05，下同)。在9個處理中，以處理8(銅添加量為20.0 mg/kg，鋅添加量為40.0 mg/kg)的方格星蟲稚蟲增重率和特定生長率最高；鋅添加量為40.0 mg/kg處理組(處理2、處理5和處理8)的方格星蟲稚蟲增重率和特定生長率顯著高于鋅添加量為80.0 mg/kg處理驗組(處理3、處理6和處理9)；當飼料銅添加量一定時，隨著飼料中鋅元素的增加，方格星蟲稚蟲的增重率和特定生長率呈先升后降的變化趨勢；當飼料鋅添加量一定時，改變銅添加量其方格星蟲稚蟲的增重率間和特定生長率間無顯著差異(P>0.05，下同)。說明飼料中添加適量鋅元素、過量銅元素不會顯著影響方格星蟲稚蟲的生長性能(處理8)，但添加適量銅元素、過量鋅元素會有效抑制方格星蟲稚蟲的生長發育(處理6)，同時過量的銅元素可在一定程度上改善過量鋅元素對方格星蟲稚蟲生長性能的影響(處理9)。因此，推斷方格星蟲稚蟲的增重率和特定生長率主要與飼料中鋅元素含量相關。

從表3和圖1～圖3可看出，飼料中添加銅和鋅對方格星蟲稚蟲增重率、特定生長率和存活率的交互效應顯著；飼料中的銅元素含量適量或偏低(5.0和10.0 mg/kg)時，隨著鋅元素添加量的升高，各處理組方格星蟲稚蟲的存活率呈先升后降的變化趨勢，說明方格星蟲稚蟲的存活率主要受飼料中鋅添加量的影響；當飼料中的銅添加量上升至20.0 mg/kg(高含量)時，方格星蟲稚蟲的存活率主要受飼料中銅添加量的影響，但處理組的稚蟲存活率差異不顯著。

表3 銅鋅交互效應對方格星蟲稚蟲生長性能的影響

圖1 銅和鋅添加量對方格星蟲稚蟲增重率的交互影響Fig.1 The interactive effect between copper and zinc on weight gain rate of juvenile peanut worm

圖2 銅和鋅添加量對方格星蟲稚蟲特定生長率的交互影響Fig.2 The interactive effect between copper and zinc on specific gain rate of juvenile peanut worm

圖3 銅和鋅添加量對方格星蟲稚蟲存活率的交互影響Fig.3 The interactive effect between copper and zinc on survival rate of juvenile peanut worm

2.2 銅鋅交互效應下方格星蟲稚蟲的體成分

從表4可看出，各處理組方格星蟲稚蟲的水分含量在81.64%～82.78%，粗蛋白含量在58.46%～65.72%，粗脂肪含量在1.45%～1.72%，灰分含量在20.92%～24.92%。方差分析結果表明，飼料中不同銅添加量和鋅添加量對方格星蟲稚蟲的上述指標均無顯著影響。

表4 銅鋅交互效應下的方格星蟲稚蟲體成分比較

2.3 銅鋅交互效應下方格星蟲稚蟲的蟲體銅和鋅含量

由表5可知，各處理組方格星蟲稚蟲蟲體的銅和鋅含量均隨著飼料中銅和鋅添加量的變化而變化。其中，飼料銅添加量為10.0和20.0 mg/kg(處理4～9)時，稚蟲蟲體銅含量顯著高于飼料銅添加量為5.0 mg/kg處理(處理1～3)；稚蟲蟲體鋅含量隨著飼料中鋅添加量的增加而顯著升高；高銅(20.0 mg/kg)高鋅(80.0 mg/kg)飼料處理(處理9)稚蟲的蟲體銅元素和鋅元素累積量最高。從圖4～5可看出，飼料中的銅和鋅添加量對方格星蟲蟲體銅和鋅含量的交互效應不顯著。

表5 銅鋅交互效應下的方格星蟲稚蟲蟲體銅和鋅含量比較

2.4 銅鋅交互效應下方格星蟲稚蟲蟲體的AKP活性

由表6可知，各處理組方格星蟲稚蟲蟲體的AKP活性均隨飼料中鋅添加量的增加呈先增后趨于平穩的變化趨勢。其中，高鋅(80.0 mg/kg)處理稚蟲的AKP活性顯著高于低鋅(5.0 mg/kg)處理，即處理1、處理4和處理7稚蟲的AKP活性較低，均顯著低于其余處理。因此推斷，方格星蟲稚蟲的AKP活性主要受飼料中鋅添加量影響，但銅和鋅2種元素對其無交互效應(圖6)。

3 討 論

微量元素是動物維持生命及其生產不可或缺的營養元素，體內微量元素的相互關系十分復雜，開展相關研究時所采用的微量元素劑量不同，微量元素間的相互關系也會發生變化[19]。影響微量元素利用率的因素主要有動物機體生理狀態、微量元素化學形式及飼料中的抗營養因子[20]。選用利用率高的微量元素螯合物，合理控制飼料中微量元素含量，摸清微量元素間的協同或拮抗作用已成為當今飼料研究的熱點[21]。許明珠等[13-14]研究表明，綜合增重率和飼料成本考慮，方格星蟲稚蟲最適銅需要量

圖4 銅鋅交互效應下的方格星蟲稚蟲蟲體銅含量Fig.4 Copper content of juvenile peanut worm under the interaction of copper and zinc

圖5 銅鋅交互效應下的方格星蟲稚蟲蟲體鋅含量Fig.5 Zinc content of juvenile peanut worm under the interaction of copper and zinc

表6 銅鋅交互效應下方格星蟲稚蟲蟲體的AKP活性比較

為7.5～11.2 mg/kg，最適鋅需要量為41.93 mg/kg。本研究結果表明，氨基酸螯合微量元素銅和鋅對方格星蟲稚蟲生長具有顯著影響，且飼料中鋅添加量的影響大于銅添加量，與前人對皺紋盤鮑[16]、黃顙魚(PelteobagrusachelliRichardsor)[17]、花魚骨(HernibarbusmacalatesBleekev)[22]、異育銀鯽(CarassiusauratusGibelio)[23]、鯉(Cyprinuscarpio)[24]的研究結果一致。本研究中，當飼料中的銅添加量一定時，增加鋅添加量的方格星蟲稚蟲增重率和特定生長率呈先升后降的變化趨勢；當飼料中的鋅添加量一定時，銅添加量發生變化但方格星蟲稚蟲的增重率和特定生長率無顯著差異；飼料中鋅元素過量會顯著降低方格星蟲稚蟲的生長性能，銅元素過量對方格星蟲稚蟲生長性能無顯著影響，但可在一定程度上改善過量鋅元素對方格星蟲稚蟲生長性能的影響。究其原因可能是銅和鋅元素二者互為競爭關系，過量的銅元素競爭了一部分鋅元素的蛋白質親和部位，從而降低過量鋅元素對方格星蟲生長的影響[12]。已有研究表明，飼料中添加過量鋅元素會抑制黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)幼魚和鯉的生長，飼料中添加適宜的鋅元素對二者的增重具有正向效應[24-25]。鋅元素過量導致的方格星蟲稚蟲生長性能降低，其原因可能在于方格星蟲沒有鰓器官，無法通過鰓排出多余的鋅，導致體內鋅累積過多，同時鋅過量會影響方格星蟲對其他元素的正常吸收，從而導致生長性能較低[26-27]。

圖6 銅鋅交互效應下方格星蟲稚蟲蟲體的AKP活性比較Fig.6 The interaction between copper and zinc on AKP activity of juvenile peanut worm

本研究結果顯示，飼料中的銅和鋅添加量對星稚蟲體成分無顯著影響，與其他學者對方格星蟲稚蟲[12]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[21]、日本沼蝦[28]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[29]進行單因素銅元素營養試驗，以及對星斑川鰈(Platichthysstellatus)[30]、半滑舌鰨(CynoglossussemilaevisGunther)[31]進行單因素鋅元素營養試驗獲得的結果相同，究其原因可能在于飼料中微量元素的增加能有效促進方格星蟲快速生長，并合理利用飼料中營養物質合成自身物質。方格星蟲主要攝食灘涂沉積物表層的有機物質和餌料，攝食過程必須利用適合口徑的沙粒作為載體，因此方格星蟲對不同元素的生物富集與其攝食的餌料密切相關。李俊偉等[ 12]研究發現，方格星蟲體內的銅和鋅元素與沉積物環境間呈一定的正相關。本研究中，飼料的銅和鋅添加量對方格星蟲稚蟲蟲體銅和鋅含量均具有顯著影響，蟲體銅和鋅含量均隨飼料中銅和鋅添加量的增加而顯著增加，飼料中銅添加量不影響鋅元素在方格星蟲蟲體內積累，但高銅高鋅處理稚蟲的蟲體銅和鋅元素累積量最高，與其他學者對皺紋盤鮑[16]、日本沼蝦[28]、中國對蝦[20]腹部鋅銅含量的研究結果一致。

AKP是一種二聚體結構的酶，其結構維持及酶活性發揮需要鎂和鋅離子參與。其中，鋅位于酶活性中心，是酶活性的必需基團之一[32]，參與催化作用，而鎂僅起調節作用。AKP是鋅元素的特征酶，主要參與降解外來生物大分子，能夠良好反映生物體內的鋅元素需求和利用率。本研究結果表明，方格星蟲稚蟲的AKP活性主要受鋅元素影響，AKP活性隨著飼料中鋅添加量的增加呈先增后趨于平穩的變化趨勢，與許明珠等[13]研究單一鋅元素對方格星蟲稚蟲AKP活性影響獲得的結果一致；在不同飼料銅水平下，高鋅添加量處理組方格星蟲稚蟲的AKP活性均顯著高于低鋅添加量處理組，其原因可能在于適當增加飼料中的鋅含量能保證方格星蟲體內富集更多鋅離子結合AKP鋅位點，從而增強AKP活性[11]。本研究中，飼料中添加高銅和適量鋅處理方格星蟲稚蟲的AKP活性顯著高于添加低銅和適量鋅處理，與其他學者對皺紋盤鮑[16]、日本沼蝦[28]的研究結果一致。這可能與鋅是銅的拮抗物有關，增加飼料中的鋅含量可降低方格星蟲對銅的吸收量，進而降低高銅引起的氧化脅迫[33]。

4 結 論

飼料中添加銅和鋅均可影響方格星蟲稚蟲生長、體成分組成、體內元素分布和積累，以及AKP活性。飼料中鋅元素對方格星蟲稚蟲生長的影響大于銅元素，飼料高銅添加量不影響方格星蟲稚蟲對鋅的吸收。以增重率為評價標準，方格星蟲稚蟲飼料中的最適銅和鋅添加量分別為20.0和40.0 mg/kg，飼料中對應的蛋氨酸銅和蛋氨酸鋅添加量分別為117.6和42.1 mg/kg。