紅栗和古栗微生物群落結構及果實養分含量的比較

姜莉莉，武海斌，宮慶濤，張甘雨，王雅紅，孫瑞紅*

（1.山東省果樹研究所/山東省現代設施果樹技術創新中心，山東 泰安 271000；2.泰安市板栗協會，山東 泰安 271035）

板栗（Castanea mollissima B L）屬殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea），其果實具有較高的營養和保健價值，深受消費者的喜愛，素有“木本糧食”之稱［1］。中國是世界板栗第一生產大國，種植面積和產量均位居世界首位［2］。

由于板栗大多種植在山區或坡地上，缺水少路，管理不便，板栗病害發生嚴重，一直是困擾栗農的重要難題，也是影響板栗質量收益的主要因素［3］。同時，部分板栗種植區與水源保護區毗鄰，病蟲害化學防控受到限制，安全、精準防控技術亟待完善［4］。

栗疫病是由子囊菌亞門核菌綱球殼目間座殼科隱叢殼屬栗疫病菌Cryphonectria parasitica （Murr.） Barr.寄生引起的真菌病害，嫁接不久、生長環境貧瘠的栗樹易感此病，易成片發生，甚至導致樹死園毀［5］。任菲等［6］報道，盾殼霉屬病原菌Coniothyrium phrinum可引發板栗葉斑病，鏈格孢屬病原菌Alternaria alternata可引起板栗葉焦枯病。姜淑霞等［7］報道，擬莖點霉屬病原菌Phomopsis mollissmae可侵染板栗引起褐緣葉枯病，并易誘發板栗疫病。板栗內腐病又稱栗種仁斑點病，可在栗果外觀正常的情況下，在種仁上產生壞死性病斑，使果仁失去食用價值［8］。張馨方等［9］報道，內腐病病原菌從6月中旬授粉期開始侵入板栗花柱和栗苞，8月中旬以后侵入的病菌數量逐漸增多，但在近成熟期病菌才侵入種仁。內腐病由多種病原菌復合侵染所致，包括膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、聚生小穴殼菌（Dothiorella grgaria）等。

山東省是我國板栗主產區之一，栽培歷史悠久，品種資源豐富［10］。泰山周邊地區分布著豐富的古板栗資源，可為板栗良種選育提供豐富且優質的種質來源［11］。本研究采用高通量測序技術，分析比較了泰安市岱岳區祝陽鎮麻塔村古栗與同村種植的“紅栗2號”［12］5年生樹不同物候期及部位的微生物群落結構差異，比較了采收期果實營養成分差異，并進行了相關性分析，以期為探索板栗病害的成災機理和科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗取樣區域

試驗區選址于山東省泰安市岱岳區祝陽鎮麻塔村（117°21′15″E，36°11′50″N），為山地板栗園。分別隨機選取3株樹齡30年以上的古栗樹和樹齡5年的“紅栗2號”進行取樣，每株為一個重復。供采樣板栗樹于2020年5月中旬噴施50%多菌靈可濕性粉劑（山東華陽農藥化工集團有限公司）1000倍液和1%阿維·吡蟲啉乳油（順毅股份有限公司）1000倍液，采用常規栽培管理。

1.2 樣品采集

分別于2020年8月26日（膨果期，p）和9月12日（成熟期，c）采集果實和葉片。以蘸有0.2 mol/L磷酸緩沖液的無菌拭子擦取板栗葉片（y）和果實（g）表面的微生物，將拭子置于無菌離心管中，干冰保存送樣。真菌和細菌群落結構的高通量分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

于2020年10月3日采集2種板栗的成熟果仁，用于養分含量測定。

1.3 測序分析

提取樣本基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，以無菌水將其濃度調整至1 ng/μL。以此基因組DNA為模板，使用帶Barcode的16 S V4區引物（515F/806R）和ITS1區引物（ITS1-1F-F/ITS1-1F-R）進行PCR擴增。PCR產物根據濃度進行等量混樣，以瓊脂糖凝膠電泳純化后進行膠回收。構建文庫，經Qubit定量和檢測合格后，進行Ion S5TMXL（Thermofisher）上機測序。

對數據進行低質量剪切，截去Barcode和引物序列，去除嵌合體序列，得到有效數據。以Uparse 7.0.1001軟件對各樣品的有效數據進行聚類，將一致性高于97%的序列聚類為OTUs，選取頻數最高的序列作為代表性序列。用Mothur方法與SSUrRNA數據庫對OTUs序列進行物種注釋分析，獲得分類學信息，并分別在界kingdom、門phylum、綱class、目order、科family、屬genus、種species共7個分類水平統計各樣本的群落組成。以數據量最少的樣本為標準進行均一化處理，并以此進行后續的α-和β-多樣性分析。

使用Qiime軟件計算Chao1、Shannon、Simpson、 ACE、Goods-coverage和PD_whole_tree 指數，使用R軟件（版本號2.15.3）繪制稀釋曲線。采用R軟件的corr.test函數計算物種和環境因子的Spearman相關系數值并檢驗其顯著性，使用pheatmap函數進行可視化。

1.4 果實養分含量的測定

可溶性淀粉含量測定采用碘顯色法［13］，可溶性總糖含量測定采用蒽酮比色法［14］，脂肪含量測定采用索氏抽提法［15］。

2 結果與分析

2.1 樣本測序深度與數據質控

由圖1可知，隨著測序深度的增加，各樣本的稀釋曲線均逐漸趨緩，表明測序深度已達到要求，能夠反映各樣本的細菌和真菌群落結構組成。

2.2 紅栗和古栗不同物候期和部位的細菌和真菌α-多樣性指數的比較

由表1可知，對細菌而言，古栗膨果期和成熟期葉片和果實的α-多樣性指數均高于紅栗，表明古栗樹體的細菌多樣性、豐度和優勢度高于紅栗；其中成熟期古栗果實（gl.g.c）最高，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指 數 分 別 為5.242、0.858、1010.069和1019.654，膨果期紅栗果實（hl.g.p）最低，分別為1.700、0.449、217.546和221.063。對真菌而言，紅栗和古栗各生育期和部位的α-多樣性指數差異不大，其中膨果期古栗葉片（gl.y.p）最高，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指 數 分 別 為5.382、0.950、721.374和712.740。

圖1 紅栗和古栗不同物候期各部位樣本的16 S和ITS稀釋曲線

表1 紅栗和古栗不同物候期和部位的細菌和真菌α-多樣性指數的比較

2.3 紅栗和古栗不同物候期和部位真菌相對豐度的比較

由圖2可知，紅栗和古栗膨果期果實（hl.g.p和gl.g.p）的尾孢屬Cercospora相對豐度均較高，紅栗成熟期葉片和果實（hl.y.c和hl.g.c）的鏈格孢菌Alternaria相對豐度均較高，古栗成熟期果實（gl.g.c）的墊殼孢屬Coniella相對豐度最高，紅栗膨果期葉片和古栗成熟期葉片（hl.y.p和gl.y.c）的莖點霉屬Phoma相對豐度較高，古栗膨果期葉片和果實（gl.y.p和gl.g.p）的枝孢屬Cladosporium相對豐度較高，紅栗成熟期葉片（hl.y.c）的柱隔孢屬Ramularia相對豐度較高，古栗成熟期葉片（gl.y.c）的短梗霉屬Aureobasidium相對豐度最高。

2.4 紅栗和古栗不同物候期和部位細菌相對豐度的比較

由圖3可知，古栗膨果期葉片（gl.y.p）的青枯菌屬Ralstonia相對豐度較高，果實（gl.g.p）的甲基桿菌屬Methylobacterium相對豐度較高。紅栗成熟期果實（hl.g.c）的滑柱菌屬Herpetosiphon相對豐度較高。古栗成熟期葉片（gl.y.c）的假單胞菌Pseudomonas相對豐度較高，果實（gl.g.c）鏈球菌屬Streptococcus和根瘤菌屬Allorhizobium相對豐度較高。

2.5 紅栗和古栗果實養分含量的比較

由表2可以看出，紅栗果實的可溶性總糖、可溶性淀粉和粗脂肪含量分別為29.70 mg/g、392.41 mg/g和0.48%，均顯著高于古栗的6.63 mg/g、322.42 mg/g和0.29%。可見紅栗的營養成分含量遠高于古栗。

表2 紅栗和古栗養分含量的比較

圖2 紅栗和古栗不同物候期和部位的真菌相對豐度

圖3 紅栗和古栗不同物候期和部位的細菌相對豐度

2.6 板栗微生物相對豐度與養分含量的相關性分析

2.6.1 板栗細菌相對豐度與養分含量的相關性分析 由圖4可以看出，板栗果實理研菌科Rikenellaceae相對豐度與淀粉含量呈顯著負相關，與脂肪含量呈極顯著負相關。短波單孢菌屬Brevundimonas相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關。埃希氏桿菌屬Escherichia相對豐度與脂肪含量呈顯著負相關。鞘氨醇單孢菌Sphingomonas相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著正相關。鏈球菌Streptococcus相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著負相關。根瘤菌Allorhizobium相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關。

2.6.2 板栗真菌相對豐度與養分含量的相關性分析 由圖5可知，板栗果實座囊菌綱Dothideomycetes相對豐度與糖、淀粉和脂肪含量均呈顯著負相關。

3 討論與結論

傳統的病原菌分離鑒定方法僅能研究可培養微生物，而對不可培養的微生物種類及豐度無法進行系統分析。高通量測序技術通過PCR擴增，對目標區域的DNA富集后進行序列測定，能夠較為全面和準確地反映微生物群落結構，已成為近年來分析微生物多樣性的常用且有效手段［16］。路穎等［17］采用高通量測序技術，分析了泰山4種優勢造林樹種刺槐、麻櫟、油松和赤松葉片凋落物分解對凋落物內細菌群落結構的影響，發現細菌群落多樣性受凋落物化學性質影響，尤其是初始碳氮比和木質素氮比。李志杰等［18］以多環芳烴污染鹽堿土壤為研究對象，采用高通量測序技術，分析了翅堿蓬根際與非根際土壤的細菌群落結構，發現翅堿蓬能夠有效降低根際土壤鹽含量并改善碳氮比，提高嗜鹽堿多環芳烴降解微生物的關鍵基因豐度。

本研究采用高通量測序技術，分析了板栗不同物候期和部位的真菌和細菌群落結構。真菌相對豐度比較發現，紅栗和古栗膨果期果實（hl.g.p和gl.g.p）的尾孢屬Cercospora相對豐度均較高，該屬真菌可引起玉米灰斑病［19］、甘蔗褐斑病［20］等病害，但對板栗果實的危害尚未見報道。紅栗成熟期葉片和果實（hl.y.c和hl.g.c）的鏈格孢菌Alternaria相對豐度均較高，表明受板栗葉焦枯病侵染的風險較大［6］。古栗成熟期果實（gl.g.c）的墊殼孢屬Coniella相對豐度最高，該屬真菌可引起石榴干腐病［21］、葡萄白腐病等病害，也包括栗生墊殼孢菌［22］。紅栗膨果期葉片和古栗成熟期葉片（hl.y.p和gl.y.c）的莖點霉屬Phoma相對豐度較高，該屬真菌可引起板栗褐緣葉枯病，并易誘發板栗疫病和內腐病。古栗膨果期葉片和果實（gl.y.p和gl.g.p）的枝孢屬Cladosporium相對豐度較高，該屬病原菌可引起番茄葉霉病［23］和多種作物果實腐爛［24］。紅栗成熟期葉片（hl.y.c）的柱隔孢屬Ramularia相對豐度較高，該屬真菌可引起山萵苣白腐病等病害［25］。古栗成熟期葉片（gl.y.c）的短梗霉Aureobasidium相對豐度最高，該屬真菌作為益生菌被廣泛報道［26-27］。細菌相對豐度比較發現，古栗膨果期葉片（gl.y.p）的青枯菌屬Ralstonia相對豐度較高，該屬病原菌可引起煙草青枯病等病害［28］。古栗膨果期果實（gl.g.p）的甲基桿菌屬Methylobacterium相對豐度較高。紅栗成熟期果實（hl.g.c）的滑柱菌屬Herpetosiphon相對豐度較高。古栗成熟期葉片（gl.y.c）的假單胞菌Pseudomonas相對豐度較高，果實（gl.g.c）鏈球菌屬Streptococcus和根瘤菌屬Allorhizobium相對豐度較高，均可作為益生菌使用［29-30］。綜合比較可以發現，紅栗受鏈格孢菌等真菌侵染風險較高，古栗樹體益生菌相對豐度較高。

圖4 板栗細菌相對豐度與養分含量的相關性分析

圖5 板栗真菌相對豐度與養分含量的相關性分析

不同產地和品種的板栗中各營養成分含量均有較大差異。本研究通過養分含量測定發現，紅栗果實的可溶性總糖、可溶性淀粉和脂肪含量均顯著高于古栗。可見經過科研人員的多年品種選育，板栗的營養成分性狀已得到系統優化和改良。相關性分析發現，短波單胞菌屬相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關，埃希氏桿菌屬相對豐度與脂肪含量呈顯著負相關，鞘氨醇單孢菌相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著正相關，鏈球菌相對豐度與淀粉和脂肪含量呈顯著負相關，根瘤菌相對豐度與脂肪含量呈顯著正相關。