PCV 與PEDV混合感染的實驗室檢測

楊克禮，陳文杰，郭 銳，周丹娜，袁芳艷，劉澤文，劉 威，高 婷，田永祥*

（1.農業農村部 畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室/湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所，湖北 武漢 430064；2.畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064）

豬 圓 環 病 毒（Porcine circovirus， PCV）是 目前已知最小的病毒之一，在分類學上屬于圓環病毒科（Circoviridae）、圓環病毒屬（Circovirus）［1］，是危害我國養豬業發展的主要致病病毒。在2019年以前，豬圓環病毒包含豬圓環病毒l型（Porcine cirovirus type l， PCV1）、豬圓環病毒2型（Porcine cirovirus type 2， PCV2）和豬圓環病毒3型（Porcine cirovirus type 3， PCV3）3個基因型［2-3］。研究證實：PCV1無致病性；PCV2和PCV3是豬圓環病毒病的主要病原體，可引發斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome， PMWS）和豬皮炎與腎病綜合征（Porcine dermatitis nephropathy syndrome， PDNS）等臨床疾病；PCV3除引起母豬繁殖障礙、皮炎腎病綜合征外，還會引起仔豬腹瀉等［2-3］，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失［4］。2019年研究人員在我國湖南省患有呼吸系統疾病、腹瀉和豬皮炎與腎病綜合征的豬群中首次檢測到了另一種新型豬圓環病毒——PCV4（Porcine cirovirus type 4），其 與 PCV1~PCV3型 具有明顯的遺傳差異［5］。隨后有學者先后在河南、山西［6］、廣西［7］和江蘇［8］等地發現PCV4出現了流行。

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea， PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）引起的一種嚴重危害豬群的病毒性傳染病。發病豬臨床特征性表現主要有嘔吐、水樣腹瀉、嚴重脫水等［9］；各年齡段豬只均可感染，以仔豬受害最重，死亡率在80%以上［10-11］。該病主要由帶毒豬及其糞便經糞-口途徑傳播。近年來，豬流行性腹瀉的發病率呈逐年上升趨勢。自2010年以來，我國流行的PEDV毒株發生了變異，特別是S基因出現了多處插入和缺失，與經典毒株CV777相比毒力增強了［12］；高毒力PEDV變異株的出現嚴重影響了我國養豬業的發展［13］。

近年來，我國多地報道了有豬圓環病毒2型和豬流行性腹瀉病毒2種甚至多種病原混合感染的情況［14-16］。為了解湖北省內規模化養豬場豬圓環病毒和豬流行性腹瀉病毒的混合感染情況，筆者對來自該省內16個規模化養豬場的650份組織樣品進行了實驗室檢測，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

逆轉錄酶M-MLV、d NTPs和Taq DNA聚合酶均購自北京全式金生物技術有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自Axygen公司；瓊脂糖及其他試劑均購自商業公司。

1.2 樣品來源

2020年6~12月，從湖北省內16個規模化養豬場采集送檢的病豬組織樣品包括血液、脾臟和淋巴結等共490份，腹瀉樣品（包括病豬的腸及內容物）160份，共650份，置于-80 ℃保存備用。

1.3 樣品處理及病毒DNA/RNA的提取

將組織樣品按1∶5的比例（W/V）加入適量、pH 7.2的PBS液，置無菌勻漿器中，研磨勻漿，反復凍融3~5次，以8000~10000 r/min離心3~5 min，取上清液400 μL，按病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書中的方法提取核酸，立即用于檢測或置于-80 ℃保存備用。

1.4 cDNA的合成

cDNA的 合 成 體 系 為20 μL體 系，其 中 含5×M-MLV反 轉 錄Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、M-MLV反 轉 錄 酶1 μL （100 U）、random Primer 1 μL （30 μmol/L）、Rnasin 1 μL、模板RNA 2 μL，用DEPC水補至20 μL。滅活（42 ℃ 2 h，95 ℃ 5 min）反轉錄酶，即得cDNA，立即用于檢測或置于-80 ℃保存備用。

1.5 PCV及PEDV的檢測

利用本研究室前期建立的豬圓環病毒多重PCR檢測方法［1］檢測PCV1、PCV2和PCV3。其引物序列如下： PCV1-F，5′-GAAAGTGAGCGGGAA GAT-3′； PCV1-R，5′-CTGATTGCTGGTAA TCAA-3′； PCV2-F，5′-CACATCGAGAAAG CGAAAGGAAC-3′； PCV2-R，5′-TGCGGGCCA AAAAAGGTACAGTT-3′； PCV3-F，5′-A GCAGTGCTCCCCATTGA-3′； PCV3-R，5′-TGGGCCCGACCAAATCCGG-3′。

PCR反應采用50 μL體系，包含10×PCR Buffer 5.0 μL、Taq聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 4.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、DNA模板5.0 μL，余下體積用DEPC水補足。

PCR反應條件：95 ℃預變性4 min； 94 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環；最后72 ℃延伸8~10 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳20~30 min，于紫外觀測儀中觀察記錄結果。

PCV4的檢測參照Sun等［7］報道的方法進行。PEDV的檢測參照Ishikawa等［17］報道的方法進行。

1.6 數據統計

對16個養殖場的PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV單一病原感染的陽性率，PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV雙重感染的陽性率，以及PCV1、PCV2、PCV3、PCV4或PEDV多重感染的陽性率分別進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單一病原感染的檢測結果

對來自16個規模化豬場的650份組織病料，應用豬圓環病毒多重PCR檢測方法、PCV4 PCR檢測方法［7］、PEDV RT-PCR檢測方法［17］分別進行PCV1-3、PCV4和PEDV的病原學檢測，單一病原感染的檢測結果詳見表1。部分樣品的檢測結果見圖1、圖2。由表1可知：除PCV4未檢出陽性外，PCV1、PCV2、PCV3或PEDV單一感染的樣品陽性率分別為1.08%、4.15%、2.46%和6.46%；豬場PCV1、PCV2、PCV3或PEDV單一感染的最高陽性 率分別為4.35%、11.11%、8.33%和13.04%。

表1 單一病原感染的檢測統計結果

圖1 部分樣品PCV的多重PCR擴增產物電泳圖

圖2 部分樣品PEDV的RT-PCR擴增產物電泳圖

2.2 雙重感染的檢測結果

對來自16個豬場的650份組織樣品，應用豬圓環病毒多重PCR檢測方法、PCV4 PCR檢測方法和PEDV RT-PCR檢測方法分別進行豬圓環病毒和豬流行性腹瀉病毒的病原學檢測，對雙重感染的樣品數分別進行統計，陽性數（陽性率）結果如表2所示：PEDV+PCV1感染的陽性數（陽性率）為2（0.31%），PEDV+PCV2為23（3.54%），PEDV+PCV3為5（0.77%），PCV1+PCV2為4（0.62%），PCV2+PCV3為10（1.54%），PCV3+PCV1為2（0.31%）。在所檢測的16家規模化豬場中，由PEDV、PCV引起的雙重感染主要是PEDV+PCV2和PCV2+PCV3 2種，其樣品陽性率分別為3.54%和1.54%，分別占雙重感染陽性樣品總數的50.00%（23/46）和21.74%（10/46）。

2.3 多重感染的檢測結果

對來自16個豬場的650份組織樣品，應用豬豬圓環病毒多重PCR檢測方法、PCV4 PCR檢測方法和PEDV RT-PCR檢測方法分別進行豬圓環病毒和豬流行性腹瀉病毒的病原學檢測，對多重感染的樣品數分別進行統計，多重感染陽性數（陽性率）的結果（表3）如下：PEDV+PCV1+PCV2感染的陽性數（陽性率）為3（0.46%），PEDV+PCV2+PCV3為13（2.00%），PEDV+PCV1+PCV3為3（0.46%），PCV1+PCV2 +PCV3為4（0.62%），PEDV+PCV1+PCV2 +PCV3為4（0.62%）。在所檢測的16家規模化豬場中，由PCV、PEDV引起的多重感染主要是PEDV+PCV2+PCV3，其樣品陽性率為2.00%，占多重感染陽性樣品總數的48.15%（13/27）。

表2 PCV、PEDV雙重感染的檢測統計結果

表3 PEDV、PCV多重感染的檢測統計結果

2.4 不同感染類型場的陽性率統計結果

為了解不同感染類型場的陽性率，按不同感染類型對陽性場數及陽性率分別進行統計，結果見表4。由表4可知：單一感染的場陽性率以PEDV最高，達87.50%，其次為PCV2，達81.25%；雙重感染的場陽性率以PEDV+PCV2最高，達75.00%，其次為PCV2+PCV3，達50%；多重感染的場陽性率以PEDV+PCV2+PCV3最高，達68.75%。

表4 PCV、PEDV不同感染類型場的陽性率統計結果

3 討論

近年來，中國豬病流行出現了新的特點：傳統疫病時有發生，并出現新的遺傳變異和流行特點；新的疫病經常暴發，并呈現迅速蔓延之勢；新發和再發傳染病的暴發和流行使養豬業面臨新的嚴峻挑戰。豬圓環病毒、豬流行性腹瀉病毒等傳統病原仍是當前危害中國養豬業的主要病原，給養豬業造成了巨大的經濟損失［15］。自2010年以來，由PEDV變異株所致仔豬腹瀉的發病率、死亡率可達100%，危害程度遠高于PEDV經典毒株［11］。2016年發現的豬圓環病毒3型、2019年發現的豬圓環病毒4型均被證實在中國豬群中廣泛存在和流行［3，5，7］。

豬圓環病毒是引起感染豬產生免疫抑制的主要疾病，豬只在感染后機體免疫功能下降，疫苗免疫失敗，從而并發或繼發感染其他病原微生物［1］。本研究發現，豬圓環病毒除可與豬流行性腹瀉病毒混合感染外，其3個基因型也常發生混合感染，且發生率較高，其中PCV2+PCV3的陽性率達1.54%，占雙重感染陽性樣品總數的21.74%；此陽性率雖然較前期調查發現的PCV2+PCV3混合感染的陽性率19.38%［18］有所下降，但PCV2+PCV3混合感染的場陽性率達50.00%，說明其仍在湖北省內的養殖場流行，應注意加強防控。本次對650份組織樣品的檢測未發現PCV4的流行，究其原因，可能是湖北省尚未發生該病，亦可能是檢測的養殖場數量有限，未能采集到PCV4的感染組織。

PEDV是危害養豬業的主要病原之一。自2010年以來，由PEDV所引起的仔豬腹瀉給我國的養豬業造成了極大的經濟損失［13，21］。隨著PEDV變異株的流行，我國多地出現了PEDV混合感染的報道［16］。徐麗華等［19］對浙江省546份樣本的病原學檢測結果表明，PEDV的陽性率為71.25%，雙重混合感染以PEDV+PoRV為主；郭曉秋等［20］報道了豫南地區218個規模豬場仔豬腹瀉主要的病原體是PEDV（94.5%），其中混合感染非常普遍，以PEDV+PCV2混合感染為主的雙重感染最為嚴重。本研究發現湖北省內PEDV的混合感染以PEDV+PCV2和PEDV+PCV2+PCV3為主，分別占雙重感染陽性樣品總數的50.00%和多重感染陽性樣品總數的48.15%，與郭曉秋等［20］的報道結果相似。相關研究發現PCV2陽性母豬所產仔豬在感染PEDV后，PEDV陽性細胞的數量顯著高于PCV2陰性母豬所產仔豬的，說明PCV2影響了PEDV的復制，在PCV2和PEDV之間可能發生了協同作用［22］，這可能是臨床上PEDV和PCV2混合感染病例較多的主要原因。

本次對湖北省內650份組織樣品的檢測結果表明，湖北省PEDV病原單一感染的陽性率為6.46%，混合感染的陽性率為8.15%，均大大低于王顥然等［16］報道的湖北省PEDV單一感染陽性率70.37%和混合感染陽性率57.41%，這可能是因為在后非洲豬瘟時代規模化養殖場管理人員的生物安全意識增強，實施了更加科學合理的生物安全防控措施，使得各類疫病的發病率均有不同程度的降低。盡管如此，考慮到免疫壓力和PCV、PEDV在進化過程中的遺傳多樣性，今后仍然需要加強對PCV、PEDV的防控。在針對非洲豬瘟、PEDV及PCV進行預防的同時，還要注意其他病原與PEDV、PCV發生混合感染。平時應加強對PEDV、PCV和其他病原體的檢測，針對養殖場的實際情況，制定科學合理的免疫程序，按時對豬舍進行日常消毒，使豬群處于良好的生長環境，提高豬群的免疫力，減少各類病原的感染。