不同精粗比日糧對山羊組織脂肪酸合成和代謝相關基因表達的影響

占今舜，詹 康，鐘小軍，霍俊宏*

（1.江西省農業科學院 畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200；2.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

肌內脂肪含量是衡量肉品質的主要指標之一，它與肌肉的多汁性、剪切力、嫩度和風味等品質性狀有關［1］。肌內脂肪沉積與脂肪酸攝取、脂肪合成和代謝有關，受畜禽品種、年齡和日糧營養水平等因素的調控［2］。楊金麗等［3］研究發現，相對于秸稈精料日糧（精粗比5∶5），青干草精料日糧（精粗比7∶3）能夠促進蒙古羔羊腿部乙酰輔酶A羧化酶ɑ、脂聯素和瘦素基因的表達，青干草精料日糧能夠促進羔羊腿部脂肪的合成。占今舜等［4］研究發現，采食精粗比70∶30日糧的犢牛肝臟、十二指腸和瘤胃中的SREBP1和ApoA mRNA相對表達量顯著高于采食精粗比60∶40日糧的；采食精粗比75∶25日糧的犢牛肝臟和十二指腸中的FASN mRNA相對表達量顯著高于采食精粗比65∶35日糧的，而FASN mRNA在瘤胃和肌肉中的相對表達量則相反；SCD1 mRNA在采食精粗比75∶25日糧的犢牛肝臟和十二指腸中的相對表達量最高。以上結果表明，不同精粗比日糧能夠影響反芻動物體內脂肪合成相關基因的表達，進而影響體內脂肪的合成。背膘和肋肉越厚，說明脂肪沉積越高。筆者在前期研究中發現，提高日糧的精粗比水平能夠提高山羊背膘厚和肋肉厚，說明提高日糧的精粗比能夠促進脂肪沉積［5］。鑒于此，研究了不同精粗比日糧對山羊組織脂肪酸合成和代謝相關基因表達的影響，旨在明確日糧影響山羊脂肪沉積是否與其調控組織脂肪酸合成和代謝相關基因的表達有關。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和飼養管理

試驗選取36只體重相近且健康的努比亞山羊（母羊），將它們隨機分成3組，每組12只羊。試驗羊分別飼喂精粗比為40∶60（精料低水平，L組）、50∶50（精料中水平，M組）和60∶40（精料高水平，H組）的全混合日糧，自由飲水。試驗于2018年11月在九江市修水縣大業牧業有限公司肉羊養殖場開始，于次年1月份結束，整個試驗為期70 d，其中預飼期為14 d，正試期為56 d。試驗日糧在等蛋能比和鈣磷比下，參照NY/T 816─2004《中國肉羊飼養標準》進行配制，其營養水平見表1。采用圈養方式飼養試驗羊，每天早上8∶00和下午17∶00進行飼喂；其他飼養管理按照養殖場的規定。

表1 不同處理的日糧組成與營養水平（干物質基礎）

1.2 組織樣品的采集

在試驗結束后，每組選擇體重相近的6只山羊進行屠宰，屠宰后取出肝臟，剪取一小塊肝臟放入凍存管中，然后放入液氮中保存；另外剪取瘤胃和小腸組織，用生理鹽水沖凈內容物后放入液氮中；最后將組織轉運至實驗室，在-80 ℃下冷凍保存，待測。

1.3 組織RNA的提取和合成

將山羊組織放在液氮中研磨粉碎，然后取50~100 mg粉碎的組織，加入1 mL的Trizol，混勻，靜置5~10 min；根據天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒說明書中的步驟進行RNA提取。在RNA提取結束后，用One Drop儀器對組織RNA的濃度和純度進行檢測。采用諾唯贊生物試劑盒進行cDNA的合成，按照試劑盒說明書配制20 μL的反應體系；反應條件為50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min；合成獲得的cDNA在-20 ℃下保存，待測。

1.4 引物設計和Real Time-PCR檢測

參照GenBank中的基因序列，用Primer 5.0軟件設計引物，引物合成由Invitrogen公司完成。引物序列見表2。按照諾唯贊生物RT-PCR試劑盒說明書中的方法配制20 μL的PCR反應體系，在Light Cycler?96 PCR儀（Roche公司）上進行PCR檢測。PCR反應條件為：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。溶解曲線的反應條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

表2 引物序列與參數

1.5 數據統計與分析

先用EXCEL 2016對試驗數據進行初步處理，根據2-ΔCt來計算目的基因的相對表達量。然后，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，用LDS法進行差異多重比較。數據分析結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同日糧對山羊組織ACOX1 mRNA表達的影響

由表3可知：ACOX1 mRNA在山羊肝臟和瘤胃中的表達量較高，在腸道中的表達量較低；ACOX1 mRNA在M組山羊瘤胃中的表達量顯著低于其他兩組（P<0.05），在L組山羊空腸中的表達量顯著高于H組（P<0.05）；在山羊肝臟和十二指腸中ACOX1 mRNA的表達量在各組間無顯著差異（P>0.05）。

表3 不同日糧對山羊組織ACOX1 mRNA表達量的影響

2.2 不同日糧對山羊組織CPT1A mRNA表達的影響

從表4中可以看出：CPT1A mRNA在山羊肝臟中的表達量較高，在瘤胃、腸道中的表達量較低；CPT1A mRNA在L組山羊瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），在M組山羊十二指腸中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05）；但在山羊肝臟和空腸中CPT1A mRNA的表達量在各組間無顯著差異（P>0.05）。

表4 不同日糧對山羊組織CPT1A mRNA表達量的影響

2.3 不同日糧對山羊組織PPAR-γ mRNA表達的影響

由表5可見：PPAR-γmRNA在山羊腸道中的表達量較高，在肝臟和瘤胃中的表達量較低；PPAR-γmRNA在L組山羊瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），在H組山羊十二指腸中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），但在肝臟和空腸中的表達量在各組間無顯著差異（P>0.05）。

表5 不同日糧對山羊組織PPAR-γ mRNA表達量的影響

2.4 不同日糧對山羊組織ACACA mRNA表達的影響

從表6可以看出：ACACA mRNA在山羊瘤胃中的表達量較高，在肝臟中的表達量較低，但在腸道中未檢測出；ACACA mRNA在M組山羊肝臟中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05），而在瘤胃中的表達量顯著低于其他兩組（P<0.05）。

表6 不同日糧對山羊組織ACACA mRNA表達量的影響

2.5 不同日糧對山羊組織FASN mRNA表達的影響

如表7所示，FASN mRNA在山羊肝臟中的表達量較高，在瘤胃中的表達量較低，但在腸道中未檢測出；FASN mRNA在L組山羊肝臟中的表達量顯著低于其他兩組（P<0.05），而在瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組（P<0.05）。

表7 不同日糧對山羊組織FASN mRNA表達量的影響

3 討論

酯酰輔酶A氧化酶（ACOX）是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化過程中脫氫反應的限速酶，將酯酰輔酶A催化成α，β-反式烯酰輔酶A［6］。ACOX家族有3種亞型，即ACOX1、ACOX2和ACOX3，它們參與過氧化物酶代謝和糖代謝，與脂肪酸代謝及甘油三酯沉積密切相關［7］。研究發現，增加ACOX1基因的表達量能夠促進脂肪酸的代謝，減少甘油三酯的沉積［8］。本試驗結果表明，用低精粗比日糧喂養的山羊組織中的ACOX1 mRNA表達量較高，說明低精粗比日糧有助于脂肪酸的代謝，降低甘油三酯的沉積。另外，ACOX1 mRNA在空腸中的表達量隨日糧精粗比的升高而呈降低趨勢，說明提高日糧的精粗比不利于脂肪酸在山羊空腸中的代謝。

肉堿脂酰轉移酶1（CPT1）是脂肪β-氧化的限速酶，它能夠催化酯酰輔酶A在線粒體內膜進行β-氧化，從而使脂肪沉積減少［9］。CPT1一般存在CPT1A、CPT1B和CPT1C這3種亞型基因。在機體內，CPT1A能夠攜帶長鏈脂肪酸進入細胞膜，促進脂肪酸β氧化，進而減少脂肪的沉積［10］。據報道，CPT1A基因在山羊肝臟中的表達量要高于在其他組織中的表達量［11］，本試驗結果與此結果一致。據報道，與低精粗比日糧相比，高精粗比日糧能夠顯著降低奶牛肝臟的CPT1A mRNA的豐度［12］，本試驗結果與此不同，可能是由品種不同造成的。本研究還發現，CPT1A mRNA在低精粗比日糧組山羊瘤胃中的表達量顯著高于其他兩組的，在中精粗比日糧組山羊十二指腸中的表達量顯著高于其他兩組的，說明低精粗比日糧能夠促進脂肪酸在山羊瘤胃中的β氧化，而中精粗比日糧有助于促進脂肪酸在十二指腸內β氧化。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）在脂肪組織中的表達量較高，是脂肪細胞分化的主要調節因子，在分化過程中能夠調節脂肪形成并調控脂質代謝［13］。PPAR-γ基因在不同組織中的表達存在差異。在本試驗中，PPAR-γ基因在山羊腸道組織中的表達量較高，在瘤胃和肝臟中的表達量較低。PPAR-γ在與其配體結合后才能激發其活性，進而發揮作用。內分泌因子、不飽和脂肪酸及其衍生物是PPAR-γ的原始配體，這些化合物能夠影響機體脂肪的沉積和促進脂肪細胞的分化。來源于草料的不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素可以增強PPAR-γmRNA的表達［14］。本試驗結果顯示，在低精粗比日糧組山羊瘤胃中PPAR-γmRNA的表達量顯著高于其他兩組的，這可能與其草料比例高，以及不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素等PPAR-γ原始配體高有關。此外，本試驗還發現高精粗比日糧能夠促進山羊十二指腸中PPAR-γ基因的表達。

乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）是機體內脂肪代謝的關鍵酶，是脂肪酸合成過程中的第一限速酶；該酶能夠催化乙酰輔酶A生成肪酸合成酶的催化底物丙二酸單酰輔酶A，再與乙酰輔酶A發生縮合反應生成多不飽和脂肪酸。抑制ACACA可以減少脂肪的生成，防止脂肪在肌肉、心臟和肝臟等組織中的積累［15］。相關研究發現，給禁食小鼠飼喂高能量和高脂肪的食物能明顯提高肝臟細胞中ACACA mRNA的表達［16］。因此，在本試驗中，中精粗比日糧組山羊肝臟中ACACA mRNA的表達量高于低精粗比日糧組的，可能與其能量高有關；而在高精粗比日糧組山羊肝臟中ACACA mRNA的表達量又有所降低，可能與日糧的能量和蛋白含量過高，從而影響到體內脂肪酸的合成與代謝有關。從本試驗結果來看，中精粗比日糧能夠降低山羊瘤胃中ACACA基因的表達。

脂肪酸合成酶（FASN）能夠將乙酰輔酶A和丙酰輔酶A轉化成軟脂酸，是脂肪酸再生的限速酶。FASN基因主要在脂肪酸合成率高的組織中表達，如肝臟和脂肪組織。FASN的過度表達會引起體內脂肪沉積［16］。占今舜等［4］研究發現，高精粗比（75∶25）日糧組犢牛肝臟中的FASN mRNA表達量顯著高于低精粗比（65∶35）日糧的，而在瘤胃中的FASN mRNA表達量則相反。本試驗結果也表明，提高日糧精粗比可能會促進山羊體內脂肪的沉積。

4 結論

低精粗比日糧能夠上調山羊瘤胃中ACOX1、CPT1A、PPAR-γ、ACACA和FASN mRNA的表達，降低肝臟中ACACA和FASN mRNA的表達。高精粗比日糧能夠上調山羊十二指腸中PPAR-γmRNA和肝臟中FASN mRNA的表達。說明不同日糧精粗比能夠通過調控脂肪酸合成和代謝相關基因的表達來影響山羊體內脂肪的沉積。