無創產前檢測技術對胎兒染色體拷貝數變異檢測的臨床意義

翟秀璋，盧 慶，賴春慧，陳丹云，劉孫榮，劉 薇，周元圓△

廣西壯族自治區南寧市第二人民醫院：1.檢驗科；2.產科，廣西南寧 530031

從1997年LO等[1]確認母體血液中存在胎兒游離DNA(cffDNA)并首次引入無創產前檢測技術(NIPT)用于常見染色體非整倍體的檢測，到2011年PETERS等[2]首次報道NIPT可用于檢測胎兒拷貝數變異(CNV)，NIPT被快速推廣應用于臨床實踐中。從檢測最常見的胎兒常染色體21/18/13-三體數目異常，逐漸擴展到性染色體非整倍體47,XXY、45,X的異常以及罕見常染色體三體、性染色體高風險甚至亞顯微水平的CNV，NIPT的檢測范圍越來越廣，越來越受到臨床醫師的青睞[3-4]。NIPT作為一項高準確度近似于產前診斷的篩查技術，具有無創、安全、高效、診斷早等優點，并在國內外臨床實踐中得到廣泛的應用，但作為一項新技術尤其是在檢測CNV的臨床應用中仍面臨諸多問題和挑戰。有的學者認為，常規NIPT只能檢測大部分片段較大的CNV(>6 Mb)，并且需要了解胎兒分數，認為其還不適合常規的臨床應用[5]。而有的學者認為，NIPT對5種常見的微缺失綜合征(DiGeorge綜合征、Cri du Chat綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Prader-Willi/Angelman綜合征、1p36缺失綜合征)具有較好的檢出效能，應大力推廣應用于臨床[4,6]。盡管人們對NIPT檢測CNV的效能及臨床應用持不同態度，但隨著NIPT應用檢測和信息分析方法不斷地優化，NIPT檢測胎兒CNV具有了可行性。2019年，我國發表的專家共識明確提出，具備良好產前診斷條件的機構可以將拷貝數變異測序(CNV-Seq)作為胎兒CNV的一線產前診斷技術而應用于臨床[7]。近年來，基于高通量測序技術的快速發展，國內外一些研究者致力于利用低深度NIPT對CNV進行檢測的研究，效果顯著[6,8-9]。本研究采用常規低深度NIPT篩查，探討NIPT在檢測CNV中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 2018年1月至2020年8月在本院行NIPT篩查的孕婦共22 998例，選擇其中篩查結果提示為CNV的90例孕婦為研究對象。納入標準：(1)單胎妊娠的孕婦；(2)NIPT檢測提示高風險、缺失、重復異常的孕婦。90例孕婦年齡18～48歲、平均(32.0±5.5)歲，孕周12～34周、平均(17.4±3.1)周。本研究經醫院醫學倫理學委員會審核批準，受試孕婦均知情本研究且簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1產前診斷 90例NIPT檢測提示胎兒染色體CNV的孕婦建議行介入性產前診斷，其中有60例孕婦接受胎兒染色體核型分析和CNV-Seq產前診斷；NIPT檢測低風險的孕婦在醫生指導下繼續接受常規產前檢查。

1.2.2NIPT檢測方法 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集孕婦外周血10 mL，冷凍低速離心機(4 ℃，1 600×g)離心15 min，收集血漿立即放入-20 ℃冰箱保存。嚴格按照核酸提取試劑盒(北京博奧晶典生物技術有限公司)說明書提取DNA，通過晶芯胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(北京博奧晶典生物技術有限公司)，經末端修復、接頭連接和缺口修復、PCR擴增、文庫定量等，采用博奧BES4000基因測序儀進行測序，測序結果依據《無創產前數據分析管理軟件》進行測序數據的分析，判斷胎兒患染色體非整倍體異常的風險值。

1.2.3羊膜腔穿刺術 所有接受介入性產前診斷的孕婦均知曉羊膜腔穿刺術風險，并簽署穿刺知情同意書，然后進行羊膜腔穿刺胎兒羊水細胞培養，行G顯帶胎兒染色體核型分析(350條帶)、CNV-Seq，CNV-Seq報告的解讀參照公共數據庫(DECIPHER、DGV、OMIM、ClinVar、ISCA、NCBI、UCSC)。

1.2.4核心家系調查 對NIPT檢測和CNV-Seq均為陽性的胎兒，為明確致病基因，給胎兒父母再生育提供指導依據，故抽取胎兒父母外周血提取DNA行CNV-Seq進行核心家系調查。

1.3隨訪 通過電話、電子病歷記錄系統進行隨訪、追蹤妊娠結局。

1.4統計學處理 數據采用Excel 2016進行處理。計數資料以例數、率表示。

2 結 果

2.1介入性產前診斷結果 60例接受介入性產前診斷的孕婦中：31例(51.67%)未發現致病性CNV或其他染色體異常；1例僅接受羊水細胞培養、胎兒染色體核型分析未見異常，但未進行CNV-Seq，故未納入統計分析；28例(46.67%)發現CNV，其中27例(病例2～28)CNV-Seq結果與NIPT檢測結果一致，1例(病例1)不一致，包括11例(30.29%)拷貝數重復和17例(60.71%)拷貝數缺失，變異主要涉及3、4、7、8、9、10、13、15、18、20、22號及X染色體，且大多數(11例)變異位于13號和X染色體，見表1。將CNV-Seq鑒定的變異與OMIM、DGV、DECIPHER等數據庫進行比對，并根據NIH和ACMG達成的技術標準和最新報告解讀，確定了16例致病性CNV(包括Prader-Willi/Angelman綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、DiGeorge綜合征、X連鎖魚鱗病等)，5例可能致病性CNV，5例臨床意義不明性CNV，2例可疑致病性/臨床意義不明CNV。因檢測方法的局限性，經染色體核型分析總共診斷出7例CNV，2例染色體結構異常，其余病例均未見異常。

表1 28例產前診斷異常病例的檢測結果及妊娠結局

2.2NIPT對CNV的檢測效能 NIPT檢測CNV的靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)、陰性預測值分別為77.14%、99.85%、49.23%、99.9%。NIPT對不同片段大小CNV檢測效能不同：(1)對CNV-Seq<5 Mb的CNV片段，NIPT檢測的PPV、靈敏度、特異度分別為66.67%、55.56%、99.97%；(2)對CNV-Seq 5～<10 Mb的CNV片段，NIPT檢測的PPV、靈敏度和特異度分別為50.00%、100.00%、99.97%；(3)對CNV-Seq≥10 Mb的CNV片段，NIPT檢測的PPV、靈敏度和特異度分別為35.48%、100.00%、99.91%。

2.3核心家系調查結果 2例(病例1、15)NIPT檢測和CNV-Seq均為陽性的胎兒核心家系調查結果見表2。根據測序結果，病例1的NIPT檢測與CNV-Seq檢測結果不一致，結合其父母CNV-Seq結果，胎兒遺傳了其父4q35.2和其母Xq28的重復片段，經調查其父母表型正常，無相關遺傳病臨床表現，經遺傳咨詢和結合B超結果，其父母選擇繼續妊娠并于足月剖腹產，新生兒表型正常。病例15父母雙方外周血CNV-Seq檢測未發現其他致病性或可疑致病性CNV，結合胎兒NIPT、CNV-Seq結果，證實胎兒CNV是新發突變且為“可疑致病性”，經遺傳咨詢，于孕28周對胎兒進行引產。

表2 2例NIPT、CNV-Seq結果及胎兒遺傳方式

2.4隨訪妊娠結局 28例產前診斷結果異常的孕婦17例引產，11例順產；31例產前診斷未見異常的孕婦中，1例胎兒因生長受限、宮內死胎而引產，1例足月順產兒多趾，其余新生兒表型未見異常。30例未進行產前診斷的孕婦中，4例因胎兒心包積液、心臟畸形等引產，1例出生后新生兒表型U型嘴，1例失訪，余24例新生兒表型正常。

3 討 論

長期以來，NIPT檢測的結果基本通過CMA進行確證，最新研究表明，CNV-seq可檢測大于100 bp的染色體結構異常和大于10%的非整倍體嵌合，比CMA應用更廣泛、檢測更靈敏[10]。本研究通過對NIPT提示CNV且接受介入性產前診斷的60例孕婦進行胎兒染色體核型分析和CNV-Seq，發現有46.67%胎兒為CNV，51.67%的胎兒未進一步發現CNV及其他染色體異常；NIPT檢測CNV的靈敏度、特異度分別為77.14%、99.85%，與既往報道相似[11-12]。本研究共發現16例致病性CNV、5例可能致病性CNV、5例臨床意義不明性CNV和2例可疑致病性/臨床意義不明CNV。這些致病性CNV涵蓋了臨床常見的5種微缺失綜合征：DiGeorge綜合征、Cri du Chat綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Prader-Willi/Angelman綜合征及Xp22.31缺失綜合征，這些常見致病性CNV胎兒除了Xp22.31缺失綜合征經過產前診斷遺傳咨詢繼續妊娠外，其余均被引產。Xp22.31缺失可導致X連鎖魚鱗病等，是罕見的皮膚病，且男女患病概率不同，研究發現這種病變有可能是良性，患者可選擇繼續妊娠[13]。上述結果表明，通過非侵入性方法鑒定意義明確的微缺失綜合征是可行的，采用NIPT篩查常見的致病性CNV有較好的檢出率，其為產前診斷遺傳咨詢提供了建設性的意見和有效幫助，為預防出生缺陷患兒提供有力的篩查技術[14]。

眾所周知，胎兒DNA水平、CNV的片段大小和位置、測序深度以及統計方法是NIPT檢測胎兒染色體CNV準確性的關鍵因素，其中CNV的片段大小是最重要的因素[12]。本研究對CNV片段大小為<5 Mb、5～<10 Mb及≥10 Mb檢出的特異度相似，分別為99.97%、99.97%、99.91%，但對CNV片段<5 Mb檢出的靈敏度(55.56%)相對較低，而CNV片段≥5 Mb則具有較高的靈敏度(100.00%)，與相關研究基本一致[12,15]，而略高于葉小青等[9]的研究。因此，常規測序深度下，NIPT用于篩查胎兒CNV具有一定的臨床應用效能，而對于小片段CNV的檢測能力有待進一步研究。

本研究NIPT檢測CNV的陽性預測值為49.23%，高于王梓茗等[12]的研究，對CNV片段<5 Mb和5～<10 Mb檢測的PPV均高于CNV片段≥10 Mb的PPV，與PEI等[5]的研究結果相似。有研究報道，導致陽性預測值較低的原因，一方面是因現行技術的局限性未能檢出小片段的CNV。另一方面是微缺失、微重復綜合征在正常人群中的患病率極低，并受其缺失、重復片段大小的影響[9,12,16]。一般認為，造成NIPT假陽性的原因包括染色體CNV、母體細胞中自身CNV、母體惡性腫瘤、限制性胎盤嵌合等，其中母體細胞中攜帶的自身CNV是造成NIPT檢測假陽性最常見原因[17]。cffDNA水平過低、嵌合體、母體染色體CNV或染色體部分缺失等多種因素可能會造成生物學假陰性結果[18]。本研究陽性預測值相對以往研究較高，主要原因是NIPT提示CNV陽性孕婦未能全部接受介入性產前診斷進行確證，致使病例較少。因此，在進行遺傳咨詢時，醫生需要向孕婦詳細告知NIPT技術的優勢和局限性，NIPT出現假陽性可以通過介入性產前診斷做進一步的診斷，然而出現假陰性常常在超聲等影像學檢查提示異?；蛱撼錾蟛虐l現，因此要重視陰性結果，加強孕期超聲檢查及隨訪追蹤。

2019年專家共識提出，NIPT篩查出胎兒CNV時，應對胎兒樣本及其父母雙方外周血標本同時做CNV-Seq確證，有利于確定CNV的來源，從而判斷胎兒CNV的致病性[7]。本研究對病例1、15進行核心家系調查：病例1遺傳了其父親4q35.2、母親Xq28的重復片段，結合其父母正常表型及遺傳咨詢，其父母選擇繼續妊娠并于足月剖腹產，新生兒表型正常；病例15父母雙方外周血CNV-Seq檢測未發現其他致病性或可疑致病性CNV，結合胎兒NIPT、CNV-Seq結果，證實胎兒CNV是新發突變且是“可疑致病性”，經遺傳咨詢，孕婦終止妊娠。SHI等[19]研究表明核心家系驗證對解讀胎兒CNV的致病性具有重要意義，為胎兒父母再生育提供正確的指導。

綜上所述，NIPT技術用于篩查胎兒CNV是可行的，因現有檢測水平的局限性，NIPT陽性結果仍需行介入性產前診斷，陰性結果也需加強超聲檢查及隨訪，做好遺傳咨詢。盡管CNV的NIPT檢測技術存在著局限性，但得益于現代分子技術，從而不斷優化NIPT的檢測效能，提高NIPT檢測CNV的陽性預測值。通過開發有效的胎兒來源細胞識別與富集技術以及無偏倚的單細胞全基因組擴增技術和高效的cffDNA富集技術，為限制性胎盤嵌合、母體腫瘤等情況下的NIPT尋找解決方案。