長鏈非編碼RNA在單發及多發性子宮肌瘤中的表達及臨床意義

黃曉莉，楊 慧，吳 玲，張春花，文海云，吳曉麗

(1.淮安市婦幼保健院婦產科，江蘇 淮安 223002；2.南京醫科大學附屬婦產醫院,江蘇 南京 210004)

子宮肌瘤是育齡期婦女最常見的良性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢，但病因尚不明確[1]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)是自身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200nt的一類RNA分子[2]。研究表明，lncRNAs雖然不能直接轉錄翻譯產生具有生物學活性的各類蛋白質，但其本身具有較強大的調控功能[3]。近年來，lncRNAs在子宮肌瘤臨床預測、診斷和治療中的作用日益受到重視，有研究將lncRNAs作為預測年輕子宮平滑肌瘤患者是否進展為靜脈內平滑肌瘤病的生物學標志[4]。本研究旨在探討lncRNAs在子宮平滑肌瘤中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究隨機選取2016年1月至2020年12月于我院因單發、多發性(≥2個)子宮肌瘤入院行手術子宮肌瘤切除術(開腹、經陰道、腹腔鏡)的25～50歲患者為研究對象，各100例。單發子宮肌瘤組患者平均年齡 39.7歲(25～50歲)，多發性子宮肌瘤組平均年齡43歲(27～50歲)。取樣的子宮肌瘤直徑均>5cm，選取其切除后或旋切術中留取的腫瘤瘤心為肌瘤組，選取內膜下1cm組子宮肌壁層為對照組，切除的標本組織存放于-80℃低溫冰箱。本研究通過淮安市婦幼保健院倫理委員會審查，患者均知情同意。

1.2 lncRNAs的篩選

采用NONCODE科學數據庫(網址為http://www.noncode.org)選取與子宮及子宮肌瘤組織相關的lncRNAs，從中篩選出子宮肌瘤相關研究尚未報道的lncRNAs：LINC00958、MIR4435、SNHG5。

1.3 研究方法

收集的臨床樣品首先抽提RNA，通過質檢合格后，RNA逆轉錄為cDNA，將樣品的目的基因以及管家基因進行PCR擴增，其產物進行梯度稀釋用于做標準曲線。實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達量基本恒定)作為內參，以樣品待測基因的值除以此樣品內參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。

1.3.1 RNA提取與質量檢測

設計并合成qRT-PCR引物(表1)，引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進行含SG(SYBR?Green)的PCR反應的優化。取適量新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品(50～100mg)，加入1mL的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)，勻漿后抽提RNA。

表1 qRT-PCR的合成引物列表

采用紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度。使用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。按照逆轉錄酶(Invitrogen)使用說明將樣品RNA逆轉錄為cDNA。

1.3.2相對定量實驗

進行相對定量實驗前，需將樣品的目的基因及管家基因進行PCR擴增，對其產物進行梯度稀釋，用以做標準曲線。將標準曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的qRT-PCR反應液中，進行qRT-PCR擴增和檢測，其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司。對檢測結果進行標準曲線分析，以對待測樣品的目的基因進行定量。相對定量實驗需進一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結果代表樣品目的基因相對含量。得出qRT-PCR實驗結果及相關圖表。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 lncRNAs在四組標本中的表達比較

方差分析顯示，LINC00958、MIR4435和SNHG5在單發性子宮肌瘤組、單發性子宮肌瘤對照組、多發性子宮肌瘤組、多發性子宮肌瘤對照組四組標本中表達量的差異均有統計學意義(F值分別是907.400、26.160、3.390，P<0.05)，見表2。

表2 lncRNAs在四組標本中的表達比較

2.2 lncRNAs在多發性子宮肌瘤患者兩組標本中的表達

對單發性肌瘤組與對照組之間、多發性肌瘤組與對照組之間進行兩兩比較，結果顯示LINC00958在單發、多發性肌瘤組中的表達(5.81×10-4±0.32×10-4、5.83×10-4±3.14×10-4)均低于其相應的對照組(1.23×10-3±0.75×10-3、1.88×10-3±0.40×10-3)，差異均有統計學意義(t值分別是79.690、32.080，P<0.05)；而MIR4435、SNHG5在單發、多發性肌瘤組中的表達與其相應的對照組之間無統計學差異(tMIR4435值分別是1.869、0.077,tSNHG5值分別是0.671、1.229，P>0.05)，見表3。

表3 lncRNAs在肌瘤組與對照組標本之間的兩兩比較

2.3 lncRNAs在單發性與多發性子宮肌瘤標本間的表達

對單發與多發性肌瘤組之間、單發與多發性肌瘤對照組之間進行兩兩比較，結果顯示LINC00958、MIR4435、SNHG5單發與多發性肌瘤對照組之間的差異均有統計學意義(t值分別是15.910、6.342、2.717，P<0.05)；MIR4435在單發與多發性肌瘤組之間的差異有統計學意義(t=6.102，P<0.05)，而LINC00958、SNHG5在單發與多發性肌瘤組之間的差異均無統計學意義(t值分別是0.421、1.071，P>0.05)，見表4。

表4 3種lncRNAs在單發性與多發性子宮肌瘤標本之間的兩兩比較

3 討論

3.1 常見的單發性子宮肌瘤和多發性子宮肌瘤存在不同

子宮肌瘤是育齡期婦女最常見的良性腫瘤，多見于30～50歲婦女，其診斷金標準為病理檢查，病理類型以子宮平滑肌瘤為主，由平滑肌及結締組織組成。子宮肌瘤的發病率呈逐年上升趨勢，但其病因與發病機制尚未明確，可能與正常肌層的細胞突變、性激素及局部生長因子間的相互作用等有關[5]。臨床上常見的肌瘤有單發性子宮肌瘤和多發性子宮肌瘤，相關文獻報道單發性子宮肌瘤是由單克隆平滑肌細胞增殖而成，而多發子宮肌瘤是由不同克隆細胞形成[6]。本研究中單發與多發性肌瘤對照組之間的lncRNA LINC00958、MIR4435、SNHG5表達差異均有統計學意義。

3.2 lncRNAs在子宮肌瘤發生、發展過程中起作用

lncRNAs以往長期被認為是人類基因組中不具有生物學功能的“暗物質”；但近年研究發現，lncRNAs可以參與人類基因的轉錄激活和轉錄后調控，在染色質修飾及基因組印記等層面也同樣能夠起到調控作用[7]。某些特定的lncRNAs在特定的腫瘤細胞中可以檢測出表達水平的改變，可作為腫瘤早期預防、診斷與治療方面新的分子生物學標記及臨床監測指標[8]。有研究采用高通量基因芯片技術方法檢測子宮肌瘤組織與正常子宮肌層組織中lncRNAs的表達情況，以期闡明lncRNAs 在子宮肌瘤發生、發展過程中的作用機制，為患者個體化基因治療提供理論依據[9]。

3.3 lncRNALINC00958、MIR4435、SNHG5在單發性和多發性子宮肌瘤中的表達

lncRNA LINC00958定位于人染色體11p15.3，參與八類腫瘤的表達上調，包括肝細胞肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌、頭頸鱗狀細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、胃癌、膀胱癌、神經膠質細胞瘤等，且與腫瘤患者的臨床病理分期以及腫瘤轉移相關[10,11]。LINC00958被廣泛研究報道為促癌基因，用于腫瘤的臨床預防、診斷、治療的新靶標，但其在子宮內膜癌的研究中被發現為抑癌基因[12]；而lncRNA LINC00958在子宮肌瘤組織中的表達尚無研究報道。子宮肌瘤雖然大多數是良性腫瘤，但也存在類似于惡性腫瘤的細胞增殖、種植、復發等情況[13]。進一步研究LINC00958在子宮肌瘤中的作用，可以為臨床預測子宮肌瘤的發生、發展提供依據。本研究發現，LINC00958在單、多發性肌瘤組中的表達均低于其相應的對照組表達，差異均有統計學意義。

MIR4435-2HG定位于人2號染色體長臂，研究表明其與卵巢癌、乳腺癌、胃腸癌和頭頸部腫瘤等有關[14-16]。Ouyang等人研究發現MIR4435-2HG可能通過P38/MAPK和VEGF途徑參與惡性腫瘤的發展[17]。MIR4435-2HG在子宮肌瘤組織中的表達尚無文獻報道，本研究發現其在單發與多發性肌瘤組之間的差異有統計學意義，但在單發及多發性子宮肌瘤標本中的MIR4435表達量與其對照組比較均無統計學差異。

SNHG5是核仁小分子非編碼RNA宿主基因家族成員之一，定位于人6q15染色體，與乳腺癌、鼻咽癌、食管癌、骨關節炎等相關[18-20]。相關研究發現，SNHG5通過SNHG5/miR-25-3p/BTG2軸在子宮內膜癌的發生發展中起著重要作用[21]。此外，SNHG5還可通過負調控miR-132，促進SOX4表達，從而促進子宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[22]。SNHG5在子宮肌瘤組織中的表達尚無文獻報道，本研究發現其在單發及多發性子宮肌瘤標本中的表達量均無統計學差異。

綜上所述，本課題通過NONCODE科學數據庫篩選出與子宮及宮頸組織相關的lncRNA LINC00958、MIR4435、SNHG5，發現LINC00958在單發及多發子宮肌瘤標本中的表達量均顯著低于肌瘤旁組織，為揭示子宮肌瘤lncRNA通路的發病分子機制，及子宮肌瘤的預測與治療提供了新線索。未來應進一步研究LINC00958如何在子宮肌瘤的發病過程發揮抑制作用，可通過檢測LINC00958的表達劃分高危人群，預測子宮肌瘤的發生。此外，以LINC00958為靶點，還可指導子宮肌瘤治療方法的選擇與應用。